Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

ونحن ممتنون للدكتور كايت زلوتكوفسكي من شركة بيوتيك لدعمهم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بموجب رقم العقد W911NF1920013 إلى PdF ووكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاعية (DARPA) ووزارة الداخلية بموجب العقد رقم 140D6319C0029 إلى PdF. ولا يعكس محتوى المعلومات بالضرورة موقف الحكومة أو سياستها، ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي.

1. ثقافة الخلية A549
<ol><li>الحفاظ على خط الخلية A549 في F-12K المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.</li>
	<li>تغيير المتوسط كل 3-4 أيام والمرور في التقاء 85٪-95٪.</li>
	<li>باختصار، شطف الخلايا مع 1 × الفوسفات العازلة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4، ما لم يشر إلى خلاف ذلك) وعلا?...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

يصف البروتوكول أسلوب تلقائي لتعداد المرفق البكتيري بالخلايا المضيفة. 10- والنهج الموصوف له عدة مزايا جذابة على الأساليب التقليدية. أولا، يمكن هذا النهج من التحديد الكمي الدقيق لعدد الخلايا المسببة للأمراض الميكروبية المرتبطة بالخلايا المضيفة الفردية. الأهم من ذلك، يمكن إجراء هذا القياس ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

الالتصاق البكتيري هو عملية حيث ترتبط البكتيريا بالخلايا أو الأسطح الأخرى. النجاح في إنشاء العدوى من قبل مسببات الأمراض البكتيرية يتطلب التصاق الخلايا المضيفة، والاستعمار من الأنسجة، وفي بعض الحالات، غزو الخلايا المضيفة1،2،3. تشكل الأمراض المعدية الناشئة تهديدات رئيسية للصحة العامة، كما يتضح من جائحة COVID-19 الأخيرة4و5و6. والأهم من ذلك، قد لا يمكن تمييز مسببات الأمراض الجديدة أو الناشئة بسهولة باستخدام النهج القائمة على الجينوم، لا سيما في الحالات التي تم فيها تصميم العامل الممرض للتهرب من الكشف أو لا يحتوي على توقيعات جينومية تحدده على أنه مسبب للأمراض. لذلك ، فإن تحديد مسببات الأمراض المحتملة باستخدام الطرق التي تقيم مباشرة السمات المميزة للتسبب في المرض ، مثل الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة ، يمكن أن يلعب دورا حاسما في تحديد مسببات الأمراض.
وقد استخدم الالتزام البكتيري للخلايا المضيفة لتقييم آليات الإمراض البكتيري لعقود1،7. التصوير المجهري8،9 وعدد وحدة تشكيل المستعمرة البكتيرية (CFU)10،11،12،13 عن طريق طلاء ما بعد العدوى هما طريقتان مختبريتان متطورتان لاختبار الالتزام الميكروبي و / أو عدوى الخلايا المضيفة14. بالنظر إلى حجم مقياس ميكرومتر للخلايا البكتيرية ، فإن تعداد الخلايا البكتيرية الملتصقة يتطلب بشكل عام استخدام تقنيات المجهر المتقدمة عالية التكبير ، وكذلك نهج التصوير عالي الدقة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، والتنظير المجهري التوسعي (ExM)15،16، والتصوير ثلاثي الأبعاد17 . بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تعداد البكتيريا المرتبطة أو المستوعبة داخل الخلايا المضيفة عن طريق طلاء سلسلة التخفيف من البكتيريا المحصودة على أجار صلب وحساب CFUsالناتجة 10،12،13. هذه الطريقة شاقة وتتضمن العديد من الخطوات اليدوية ، والتي تقدم صعوبات في إنشاء إجراء موحد أو آلي مطلوب للتحليلات عالية الإنتاجية18،19. ولذلك، فإن تطوير أساليب جديدة لتقييم مرفق الخلية المضيفة سيعالج القيود الحالية في الحقل.
ويرد وصف إحدى هذه الطرق هنا التي تستخدم المجهر الآلي عالية الإنتاجية، جنبا إلى جنب مع معالجة الصور ذات الإنتاجية العالية والتحليل الإحصائي. لإثبات هذا النهج ، تم إجراء تجارب مع العديد من مسببات الأمراض البكتيرية ، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، وهو ممرض بكتيري انتهازي سلبي الغرام من البشر والحيوانات والنباتات14،20، والذي غالبا ما يتم العثور عليه لاستعمار الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من ضعف وظائف الدفاع المضيف. هذا النهج الأمثل لعملية التصوير المجهرية الموصوفة في الدراسات السابقة14،20. تم تبسيط الكشف عن التصوير من خلال الخلايا المضيفة والبكتيريا ذات العلامات الفلورية لتتبع قربها بسرعة ، مما قلل بشكل كبير من عبء عمل المجهر للحصول على صور عالية الدقة لتمييز البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، حل التحليل الإحصائي الآلي للصور في عد الخلايا المضيفة والبكتيريا محل التجربة اليدوية للطلاء البكتيري CFU لتقدير نسبة العد البكتيري الملتصق لكل خلية مضيفة. لتأكيد توافق هذه الطريقة ، تم اختبار العديد من السلالات البكتيرية وأنواع الخلايا المضيفة ، مثل الليستيريا أحادية الخلايا، المكورات العنقودية، عصيات cereus ، والالتهاب الرئوي Klebsiella ، وكذلك الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs) ، وتدعم النتائج تنوع وفعالية الطريقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية الناشئة أمر بالغ الأهمية لصحة الإنسان وأمنه. يعد الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة خطوة أساسية في العدوى البكتيرية ويشكل سمة مميزة للتهديد المحتمل. لذلك ، يمكن استخدام فحص التزام البكتيريا بالخلايا المضيفة كعنصر من عناصر تقييم التهديد البكتيري. وهناك طريقة قياسية لتعداد الالتزام البكتيري للخلايا المضيفة هو المشاركة في احتضان البكتيريا مع الخلايا المضيفة، وحصاد البكتيريا الملتصقة، ولوحة الخلايا المحصودة على وسائل الإعلام الصلبة، ومن ثم عد وحدات تشكيل مستعمرة الناتجة (CFU). بدلا من ذلك، يمكن تقييم الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة باستخدام النهج القائمة على المجهر المناعي. بيد أن الاستراتيجيات التقليدية لتنفيذ هذه النهج تستغرق وقتا طويلا ولا تتسم بالكفاءة. هنا، يتم وصف طريقة التصوير الآلي المضروبة القائمة على الفلورسينس التي تم تطويرها مؤخرا. عند دمجها مع معالجة الصور عالية الإنتاجية والتحليل الإحصائي ، تمكن الطريقة من التحديد الكمي السريع للبكتيريا التي تلتزم بالخلايا المضيفة. تم اختبار نوعين بكتيريين ، السودوموناس aeruginosa سلبية الغرام والليستيريا monocytogenes إيجابية الغرام والضوابط السلبية المقابلة ، لإثبات البروتوكول. وتبين النتائج أن هذا النهج يعدد بسرعة ودقة البكتيريا الملتصقة ويقلل بشكل كبير من أعباء العمل التجريبية والجداول الزمنية.

لتطوير مضان التصوير القائم على فحص الالتزام البكتيري، P. aeruginosa سلالة PAO1 ونظيره السلبية الالتزام E. القولونية استخدمت لاختبار فعالية البروتوكول، كما تم الإبلاغ عن التزام هذه البكتيريا إلى خلايا A54914،20،22. أولا، تم احتضان GFP- المسمى...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

الكشف عن التفاعلات الممرضة البكتيرية المضيفة على أساس الالتزام phenotypic باستخدام عالية الإنتاجية التصوير الوسم الفلوري جنبا إلى جنب مع أساليب التحليل الإحصائي الآلي تمكن التقييم السريع للتفاعلات البكتيرية المحتملة مع الخلايا المضيفة.

الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

توفر هذه الطريقة اكتشافا سريعا وعالي الإنتاجية لبكتيريا الالتزام بالخلايا المضيفة. بالمقارنة مع طرق الطلاء التقليدية ، فإنه يقلل من الوقت العملي اللازم للقياس الكمي للبكتيريا الملتصقة. هذه التقنية مؤتمتة وموفرة للوقت وقابلة للاستنساخ للغاية.كما أنها تطبق على نطاق واسع على حد سواء على حد سواء لمعظم الخلايا المضيفة. هذه الطريقة، هناك واضحة جدا. بالنسبة للتجربة الأولى ، يجب تحسين ظروف مثل تعدد العدوى ، وكذلك وقت الحضانة المشتركة للبكتيريا المضيفة.حصاد الثقافات البكتيرية الأولى في مرحلة أسية عن طريق الطرد المركزي في 13،000 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل البليت الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحد ملليلتر، resuspend لوحة البكتيرية في برنامج تلفزيوني واحد ملليلتر. تحديد تركيزات التعليق البكتيري عن طريق قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر.ثم، لتلطيخ تعليق البكتيرية، إضافة اثنين من microliters من 500 أضعاف تتركز الأسهم الخضراء أو الحمراء صبغ تلطيخ في ملليلتر واحد من التعليق البكتيري لتخفيف الصبغة أضعاف واحدة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع دوران لطيف في الظلام. بعد 30 دقيقة، طرد البكتيريا الملطخة في 13، 000 مرة G لمدة دقيقتين وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.جمع الخلايا البكتيرية الملطخة عن طريق الطرد المركزي في 13،000 مرة G لمدة دقيقتين. إعادة ضغط بيليه في ملليلتر واحد من F12 K المتوسطة الطازجة وقياس الكثافة البصرية لكل ثقافة في 600 نانومتر. بعد ذلك تمييع الثقافات إلى التركيزات المطلوبة على أساس تعدد العدوى وتركيز الخلايا المضيفة.لالتحواز البكتيرية المقايسة، وغسل طبقات أحادية الخلية A549 المستزرعة سابقا ثلاث مرات عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني دافئ إلى كل بئر وماصة بلطف صعودا وهبوطا. ثم تجاهل برنامج تلفزيوني. بدلا من ذلك، بعد إضافة برنامج تلفزيوني، انتظر لمدة 10 ثوان ومن ثم إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام فراغ.لتحديد الحركية من الارتباط البكتيري، تراكب الخلايا مع 100 ميكرولتر من التركيزات المطلوبة من التعليق البكتيري مع تعدد مختلف من العدوى. قم بتدفير البكتيريا واحتضان خلايا A549 المصابة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إضافية. إزالة البكتيريا غير المنضمة عن طريق غسل طبقات أحادية خمس مرات مع برنامج تلفزيوني دافئ كما هو موضح.بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ من الفورمالديهايد في جميع آبار لوحة بئر 96 على الجليد. بعد 15 دقيقة، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة محلول التثبيت. وصمة عار في النوى مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر وصمة عار DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وتغطية الخلايا A549 المصابة مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتجنب التجفيف ومن ثم تخزين لوحة في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين في الظلام أو المضي قدما للتصوير. للحفاظ على سلامة البيانات، اختر عشوائيا ويدويا خمسة مواقع لكل بئر لالتقاط الصور بمعدل تكبير 20 مرة. التقاط الصور الفلورية للبكتيريا تحت قنوات GFP، A549 الخلايا تحت DAPI، وبالنسبة للبكتيريا الملطخة صبغة الفلورسنت الأحمر استخدام PE Si خمس قنوات.تعيين المعلمات من الكرة المتداول لتجانس والسيارات قياس نقطة انتشار وظيفة من deconvolution الصورة على أساس الهدف لتحقيق دقة أفضل. قياس كثافة الفلورسينس من الخلايا المضيفة والبكتيريا. تعيين أضعف كثافة مضان من الخلايا المضيفة والبكتيريا كعتبات لعدد الخلايا والعد جميع البكتيريا القريبة من خلية مضيفة ضمن مسافة 15 ميكرومتر كبكتيريا الالتزام.بمجرد أن يتم حساب الخلايا من جميع الصور الآلية ، قم بتحليل القراءات الحرجة ، مثل تعداد الخلايا المضيفة ، وأحجام الخلايا وأشكالها ، وإجمالي عدد البكتيريا ، ومتوسط الحساب البكتيري لكل خلية مضيفة ، وهو أهم مؤشر لتحديد الالتزام البكتيري. بعد ساعة واحدة من الحضانة المشتركة، انضمت pseudomonas aeruginosa سلالة PAO1 إلى خلايا A549 بطريقة تعتمد على الجرعة. ولوحظت أيضا نتائج مماثلة عندما البكتيريا الليستيريا أحادية النسيلة إيجابية الغرام وعصيات السيطرة السلبية subtilis.صورة تمثيلية للمضيف المنضم P aeruginosa تجزئة يوضح سهولة عد الخلايا البكتيرية باستخدام هذا البروتوكول. وتشمل نتائج التحليلات الآلية عدد الخلايا البكتيرية والمضيفة، ومتوسط عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة وأحجام الخلايا المضيفة والمناطق التي تمثل حالة صحة الخلية المضيفة، ومستوى الالتزام البكتيري وسمية الخلايا البكتيرية. وبصرف النظر عن خلايا A549، تم اختبار HUVECs أيضا لفحص الالتزام.كانت سيراتيا روبيدايا وبكتيريا العقديات agalactiae ملتزمة HUVEC ، ولكن ليس لخلايا A549 ، والذي يدل على الكشف الفعال وملاءمة المضيفين متعددة لدراسة التفاعلات البكتيريا المضيفة باستخدام هذه الطريقة. يجب أن تصل الخلايا المضيفة إلى حوالي 90 إلى التقاء 100٪ لتقليل التزام البكتيريا غير المرغوب فيها بأسفل الآبار. وستسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف الآليات الجديدة، وهي التفاعلات بين المضيف والآفات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em&gt; البروسيلا</em&gt; إصابة خلايا هيلا

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

فحص عالي الإنتاجية للمركبات الكيميائية لتوضيح آثارها على الثبات البكتيري

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...