Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Dr. Kaite Zlotkowski af Biotek Inc. for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet under kontraktnummer W911NF1920013 til PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) og Indenrigsministeriet i henhold til kontrakt nr. 140D6319C0029 til PdF. Oplysningernes indhold afspejler ikke nødvendigvis regeringens holdning eller politik, og der bør ikke udledes nogen officiel godkendelse.

1. A549 cellekultur
<ol><li>A549-cellelinjen i F-12K-medium suppleret med 10 % fosterkvægsserum (FBS) og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Skift medium hver 3-4 dage og passage på 85% -95% sammenløb.</li>
	<li>Skyl kortvarigt cellerne med 1 x fosfatbufferet saltvand (PBS, pH 7.4, medmindre andet er angivet) og behandl med 1 ml 0,25 % Trypsin-0,53 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) opløsning (nedsænkning af cellelaget) i ca. 2 min. ved 37 °C.</li>
	<li>Tilføj yderligere 6 mL komplet væks...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Protokollen beskriver en automatiseret tilgang til optælling af bakteriel vedhæftet fil til værtsceller. Den beskrevne tilgang har flere attraktive fordele i forhold til konventionelle metoder. For det første muliggør denne tilgang en præcis kvantificering af antallet af mikrobielle patogenceller, der er fastgjort til individuelle værtsceller. Det er vigtigt, at denne kvantificering kan udføres uden behov for besværlig bakteriehøst, serielle fortyndinger, plating på faste medier og bestemmelse af CFUs<sup clas...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Bakteriel vedhæftning er en proces, hvor bakterier tillægger andre celler eller overflader. Vellykket etablering af infektion med bakterielle patogener kræver vedhæftning til værtsceller, kolonisering af væv og i nogle tilfælde invasion af værtsceller1,2,3. Nye smitsomme sygdomme udgør store trusler mod folkesundheden, som det fremgår af den seneste covid-19-pandemi4,5,6. Det er vigtigt, at nye eller nye patogener ikke umiddelbart kan skelnes ved hjælp af genomiske tilgange, især i tilfælde, hvor patogenet er blevet manipuleret til at undgå påvisning eller ikke indeholder genomiske signaturer, der identificerer det som patogent. Derfor kan identifikation af potentielle patogener ved hjælp af metoder, der direkte vurderer kendetegnende for patogenitet, som bakteriel overholdelse af værtsceller, spille en afgørende rolle i patogenidentifikation.
Bakteriel tilslutning til værtsceller er blevet brugt til at evaluere mekanismer af bakteriel patogenese i årtier1,7. Mikroskopisk billeddannelse8,9 og optælling af bakteriekolonidannende enhed (CFU)10,11,12,13 ved post-infektion plating er to veludviklede laboratoriemetoder til test af mikrobiel tilslutning og / eller infektion af værtsceller14. I betragtning af mikrometerskalastørrelsen af bakterieceller kræver optællingen af de klæbende bakterieceller generelt brug af avancerede mikroskopiteknikker med høj forstørrelse samt billeddannelsesmetoder i høj opløsning, herunder elektronmikroskopi, ekspansionsmikroskopi (ExM)15,16og tredimensionel billeddannelse17 . Alternativt kan optællingen af bakterier, der er bundet til eller internaliseret i værtsceller, udføres ved at plating fortyndingsserien af høstede bakterier på fast agar og tælle de resulterende CFO'er10,12,13. Denne metode er besværlig og indeholder mange manuelle trin, som indfører vanskeligheder med at etablere en standardiseret eller automatiseret procedure, der kræves til analyser med højoverførselshastighed 18,19. Derfor vil udviklingen af nye metoder til evaluering af vedhæftede værtsceller adressere de aktuelle begrænsninger i feltet.
En sådan metode er beskrevet her, der bruger automatiseret høj gennemløbsmikroskopi kombineret med høj gennemløbsbilledbehandling og statistisk analyse. For at demonstrere tilgangen blev der udført eksperimenter med flere bakteriepatogener, herunder Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk Gram-negativt bakteriepatogen hos mennesker, dyr og planter14,20, som ofte viser sig at kolonisere luftvejene hos patienter med nedsat værtsforsvarsfunktioner. Denne fremgangsmåde optimerede den mikroskopiske billedbehandlingsproces, der er beskrevet i tidligere undersøgelser14,20. Billeddannelsesdetektering blev forenklet af fluorescensmærkede værtsceller og bakterier for hurtigt at spore nærheden af dem, hvilket dramatisk reducerede mikroskopibelastningen for at få billeder i høj opløsning til at skelne bakterier. Derudover erstattede den automatiserede statistiske analyse af billeder i optælling af værtsceller og bakterier det hånd-on eksperiment med bakteriel CFU-plating for at estimere forholdet mellem klæbende bakterietal pr. Værtscelle. For at bekræfte kompatibiliteten af denne metode er der også testet flere bakteriestammer og værtscelletyper, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus og Klebsiella pneumoniae samt menneskelige navlestrengsveendotelceller (HUVECs), og resultaterne understøtter metodens mangfoldighed og effektivitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

Identifikation af nye bakteriepatogener er afgørende for menneskers sundhed og sikkerhed. Bakteriel tilslutning til værtsceller er et vigtigt skridt i bakterielle infektioner og udgør et kendetegn for potentiel trussel. Derfor kan undersøgelse af klæbeevnen af bakterier til værtsceller bruges som en komponent i bakteriel trusselsvurdering. En standardmetode til optælling af bakteriel tilslutning til værtsceller er at inkubere bakterier med værtsceller, høste klæbebakterierne, plade de høstede celler på faste medier og derefter tælle de resulterende kolonidannende enheder (CFU). Alternativt kan bakteriel overholdelse af værtsceller evalueres ved hjælp af immunofluorescence mikroskopi-baserede tilgange. De konventionelle strategier for gennemførelse af disse tilgange er imidlertid tidskrævende og ineffektive. Her beskrives en nyligt udviklet automatiseret fluorescensmikroskopibaseret billeddannelsesmetode. Når det kombineres med høj-throughput billedbehandling og statistisk analyse, metoden muliggør hurtig kvantificering af bakterier, der klæber til værtsceller. To bakteriearter, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa og Gram-positive Listeria monocytogenes og tilsvarende negative kontroller, blev testet for at demonstrere protokollen. Resultaterne viser, at denne tilgang hurtigt og præcist opregner klæbende bakterier og reducerer eksperimentelle arbejdsbelastninger og tidslinjer betydeligt.

For at udvikle fluorescens imaging-baserede bakteriel tilslutning assay, P. aeruginosa stamme PAO1 og dens negative tilslutning modstykke E. coli blev brugt til at teste protokollen effektivitet, som tilslutning af disse bakterier til A549 celler var blevet rapporteret14,20,22. For det første blev GFP- mærket P. aeruginosa (PAO1) og GFP-mærket E. coli inkuberet sammen med en human udødelig...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Påvisning af host-bakterielle patogen interaktioner baseret på fænotypisk tilslutning ved hjælp af høj-throughput fluorescens mærkning billeddannelse sammen med automatiserede statistiske analysemetoder muliggør hurtig evaluering af potentielle bakterielle interaktioner med værtsceller.

Automatiseret, høj-gennemløbsdetektering af bakteriel overholdelse af værtsceller

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Denne metode giver en hurtig, høj-throughput påvisning af bakterier tilslutning til værtsceller. Sammenlignet med de konventionelle plating metoder reducerer det hands-on tid, der kræves til kvantificering af klæbende bakterier. Denne teknik er automatiseret, tidsbesparende og meget reproducerbar.Det er også en udbredt både for de fleste af værtscellerne. Denne metode er der meget ligetil. Til det første forsøg skal betingelserne som infektionens mangfoldighed og også værtsbakteriernes inkubationstid optimeres.Høst først bakteriekulturerne i en eksponentiel fase ved centrifugering ved 13.000 gange G i to minutter ved stuetemperatur. Efter vask af cellerne palle med en milliliter PBS, genbruge bakteriepaletten i en milliliter PBS. Bestem koncentrationerne af bakteriel suspension ved at måle optisk densitet ved 600 nanometer.Derefter til farvning af bakterieophænget tilsættes to mikrolitere af den 500 gange koncentrerede bestand grøn eller rød farvning farvestof i en milliliter bakteriel suspension for at fortynde farvestoffet en fold. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 minutter med blid rotation i mørket. Efter 30 minutter centrifugere de farvede bakterier på 13.000 gange G i to minutter og genbruge pellet i en milliliter PBS.Saml de farvede bakterieceller ved centrifugering ved 13.000 gange G i to minutter. Resuspend pellet i en milliliter frisk F12 K medium og måle den optiske tæthed af hver kultur på 600 nanometer. Efterfølgende fortyndes kulturerne til de ønskede koncentrationer baseret på infektionens mangfoldighed og værtscellekoncentrationen.For bakteriel adherence Assay, vaske den tidligere kultiverede A549 celle mono lag tre gange ved at tilføje 100 mikroliter af varm PBS til hver brønd og forsigtigt pipette op og ned. Kassér derefter PBS. Alternativt, efter at have tilføjet PBS, skal du vente i 10 sekunder og derefter fjerne PBS ved hjælp af vakuum.For at bestemme kinetikken i bakterieforeningen overlejrer cellerne med 100 mikroliter af ønskede koncentrationer af bakteriel suspension med forskellige multiplicitet af infektion. Spin ned bakterierne og inkubere de inficerede A549 celler ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i yderligere en time. Fjern de ubundne bakterier ved at vaske monolagene fem gange med varm PBS som demonstreret.Derefter skal du rette cellerne ved at tilføje 100 mikroliter på 4% formaldehyd i alle brønde af en 96 brøndplade på isen. Efter 15 minutter vaskes pladen tre gange med PBS for at fjerne fikseringsopløsningen. Plet i kernerne med 50 nanogram pr. milliliter DAPI-plet i 10 minutter ved stuetemperatur.Efter vask af cellerne med PBS, dække de inficerede A549 celler med 100 mikroliter af PBS for at undgå tørring og derefter gemme pladen på fire grader Celsius i op til to dage i mørke eller fortsætte til billeddannelse. For at bevare dataintegriteten skal du tilfældigt og manuelt vælge fem placeringer af hver brønd for at tage billederne ved 20 gange forstørrelse. Fang de fluorescerende billeder af bakterier under GFP-kanaler, A549-celler under DAPI og for de bakterier, der farves af det røde fluorescerende farvestof, bruger PE Si fem kanal.Indstil parametrene for den rullende bold til udjævning og auto måle punkt spredning funktion billede deconvolution baseret på målet for at opnå bedre opløsning. Mål fluorescensintensiteten af værtscellerne og bakterierne. Indstil den svageste fluorescensintensitet af værtsceller og bakterier som tærskler for celletælling og tæl alle bakterierne, der er tæt på en værtscelle inden for 15 mikrometerafstand som tilslutningsbakterier.Når cellerne er blevet talt fra alle de automatiserede billeder, analysere kritiske udlæsninger, såsom værtscelletal, cellestørrelser og former, samlede bakterielle tæller, og den gennemsnitlige bakterielle konto pr værtscelle, som er den vigtigste indikator til at bestemme bakteriel tilslutning. Efter en times co inkubation, pseudomonas aeruginosa stamme PAO1 overholdt A549 celler i en dosis afhængig måde. Lignende resultater blev også observeret, når gram-positive bakterier listeria monocytogenes og dens negative kontrol bacillus subtilis.Et repræsentativt billede af værten klæbende P aeruginosa segmentering viser den lethed at tælle bakterieceller ved hjælp af denne protokol. Resultaterne af de automatiserede analyser omfatter bakterie- og værtscelletal, de gennemsnitlige bakterietal pr. værtscelle og værtscellestørrelser og områder, der repræsenterer status for værtscellesundhed, bakteriel tilslutningsniveau og bakteriel cytotoksicitet. Bortset fra A549-celler blev HUVECs også testet for tilslutningsanalyse.Serratia rubidaea og streptokokker agalactiae var tilhængere af HUVEC, men ikke til A549 celler, og som viser den effektive påvisning og egnethed af flere værter til at studere værtsbakterier interaktioner ved hjælp af denne metode. Værtsceller bør nå omkring 90 til 100% sammenløb for at minimere de uønskede bakterier tilslutning til bunden af brøndene. Denne teknik vil gøre det muligt for forskere at udforske de nye mekanismer, værts-skadedyr interaktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi assays for high-throughput screening af Host faktorer involveret i<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion af HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering af en permeabel membran Insert-baserede infektion System at studere virkningerne af udskilt bakterielle toksiner på pattedyrværtsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Ved hjælp af en bakteriel patogen til sonden for cellulære og organismens-niveau vært svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Screening af kemiske forbindelser med høj gennemstrømning for at belyse deres virkninger på bakteriel persistens

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...