Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
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Nous sommes reconnaissants au Dr Kaite Zlotkowski de Biotek Inc. pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense sous le numéro de contrat W911NF1920013 à PdF, la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) et le ministère de l’Intérieur sous le numéro de contrat 140D6319C0029 à PdF. Le contenu de l’information ne reflète pas nécessairement la position ou la politique du gouvernement, et aucune approbation officielle ne devrait être déduite.

1. Culture cellulaire A549
<ol><li>Maintenir la lignée cellulaire A549 en milieu F-12K complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et incuber à 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Changez le milieu tous les 3-4 jours et passez à 85% -95% de confluence.</li>
	<li>Rincez brièvement les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, sauf indication contraire) et traiter avec 1 ml de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % de trypsine-0,53 mM (EDTA) (immersion...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Le protocole décrit une approche automatisée pour dénombrer l’attachement bactérien aux cellules hôtes. L’approche décrite présente plusieurs avantages intéressants par rapport aux méthodes conventionnelles. Tout d’abord, cette approche permet de quantifier avec précision le nombre de cellules pathogènes microbiennes attachées à des cellules hôtes individuelles. Il est important de noter que cette quantification peut être effectuée sans avoir besoin d’une récolte bactérienne laborieuse, de dilut...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

L’adhésion bactérienne est un processus par lequel les bactéries se fixent à d’autres cellules ou surfaces. L’établissement réussi de l’infection par des agents pathogènes bactériens nécessite l’adhésion aux cellules hôtes, la colonisation des tissus et, dans certains cas, l’invasion des cellules hôtes1,2,3. Les maladies infectieuses émergentes constituent des menaces majeures pour la santé publique, comme en témoigne la récente pandémie deCOVID-19 4,5,6. Il est important de noter que les agents pathogènes nouveaux ou émergents peuvent ne pas être facilement discernés à l’aide d’approches génomiques, en particulier dans les cas où l’agent pathogène a été conçu pour échapper à la détection ou ne contient pas de signatures génomiques qui l’identifient comme pathogène. Par conséquent, l’identification d’agents pathogènes potentiels à l’aide de méthodes qui évaluent directement les caractéristiques de la pathogénicité, comme l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes, peut jouer un rôle essentiel dans l’identification des agents pathogènes.
L’adhérence bactérienne aux cellules hôtes a été utilisée pour évaluer les mécanismes de pathogenèse bactérienne pendant les décennies1,7. L’imagerie microscopique8,9 et le dénombrement de l’unité de formation de colonies bactériennes (UFC)10,11,12,13 par placage post-infection sont deux méthodes de laboratoire bien développées pour tester l’adhérence microbienne et / ou l’infection des cellules hôtes14. Compte tenu de la taille micrométrique des cellules bactériennes, le dénombrement des cellules bactériennes adhérentes nécessite généralement l’utilisation de techniques avancées de microscopie à fort grossissement, ainsi que d’approches d’imagerie à haute résolution, y compris la microscopie électronique, la microscopie à expansion (ExM)15,16et l’imagerie tridimensionnelle17 . Alternativement, le dénombrement des bactéries liées ou internalisées dans les cellules hôtes peut être effectué en plaquant la série de dilution des bactéries récoltées sur une gélose solide et en comptant les UFC résultantes10,12,13. Cette méthode est laborieuse et comprend de nombreuses étapes manuelles, ce qui introduit des difficultés dans l’établissement d’une procédure standardisée ou automatisée requise pour les analyses à haut débit18,19. Par conséquent, l’élaboration de nouvelles méthodes d’évaluation de l’attachement des cellules hôtes permettrait de remédier aux limites actuelles dans le domaine.
Une telle méthode est décrite ici qui utilise la microscopie automatisée à haut débit, combinée au traitement d’images à haut débit et à l’analyse statistique. Pour démontrer l’approche, des expériences avec plusieurs agents pathogènes bactériens ont été effectuées, y compris Pseudomonas aeruginosa, un pathogène bactérien opportuniste à Gram négatif des humains, des animaux et des plantes14,20, qui colonise fréquemment les voies respiratoires de patients présentant des fonctions de défense de l’hôte altérées. Cette approche a optimisé le processus d’imagerie microscopique décrit dans les études précédentes14,20. La détection par imagerie a été simplifiée par des cellules hôtes et des bactéries marquées par fluorescence pour suivre rapidement leur proximité, ce qui a considérablement réduit la charge de travail de microscopie pour obtenir des images haute résolution permettant de distinguer les bactéries. En outre, l’analyse statistique automatisée des images dans le comptage des cellules hôtes et des bactéries a remplacé l’expérience pratique du placage bactérien CFU pour estimer le rapport du nombre de bactéries adhérentes par cellule hôte. Pour confirmer la compatibilité de cette méthode, plusieurs souches bactériennes et types de cellules hôtes ont également été testés, comme Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus et Klebsiella pneumoniae, ainsi que des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et les résultats soutiennent la diversité et l’efficacité de la méthode.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

L’identification des agents pathogènes bactériens émergents est essentielle à la santé et à la sécurité humaines. L’adhésion bactérienne aux cellules hôtes est une étape essentielle dans les infections bactériennes et constitue une marque de menace potentielle. Par conséquent, l’examen de l’adhérence des bactéries aux cellules hôtes peut être utilisé comme composante de l’évaluation de la menace bactérienne. Une méthode standard pour dénombrer l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes consiste à co-incuber les bactéries avec les cellules hôtes, à récolter les bactéries adhérentes, à plaquer les cellules récoltées sur des milieux solides, puis à compter les unités formant des colonies (UFC) résultantes. Alternativement, l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes peut être évaluée à l’aide d’approches basées sur la microscopie à immunofluorescence. Cependant, les stratégies conventionnelles de mise en œuvre de ces approches prennent beaucoup de temps et sont inefficaces. Ici, une méthode d’imagerie automatisée basée sur la microscopie à fluorescence récemment développée est décrite. Lorsqu’elle est combinée avec un traitement d’image à haut débit et une analyse statistique, la méthode permet une quantification rapide des bactéries qui adhèrent aux cellules hôtes. Deux espèces bactériennes, Pseudomonas aeruginosa à Gram négatif et Listeria monocytogenes à Gram positif et les témoins négatifs correspondants, ont été testées pour démontrer le protocole. Les résultats montrent que cette approche dénombre rapidement et avec précision les bactéries adhérentes et réduit considérablement les charges de travail et les délais expérimentaux.

Pour développer le test d’adhérence bactérienne basé sur l’imagerie par fluorescence, la souche PAO1 de P. aeruginosa et son homologue à adhérence négative E. coli ont été utilisés pour tester l’efficacité du protocole, car l’adhérence de ces bactéries aux cellules A549 avait été rapportée14,20,22. Tout d’abord, P. aeruginosa (PAO1) et E. coli marqué GFP ont été co...

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Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

La détection des interactions pathogènes hôte-bactérien basée sur l’adhérence phénotypique à l’aide de l’imagerie de marquage par fluorescence à haut débit ainsi que de méthodes d’analyse statistique automatisées permet une évaluation rapide des interactions bactériennes potentielles avec les cellules hôtes.

Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Cette méthode permet une détection rapide et à haut débit de l’adhérence des bactéries aux cellules hôtes. Par rapport aux méthodes de placage conventionnelles, il réduit le temps pratique nécessaire à la quantification des bactéries adhérentes. Cette technique est automatisée, rapide et très reproductible.Il est également largement appliqué à la plupart des cellules hôtes. Cette méthode, il y a très simple. Pour le premier essai, les conditions telles que la multiplicité de l’infection, ainsi que le temps de co-incubation de la bactérie hôte doivent être optimisés.Récoltez d’abord les cultures bactériennes à une phase exponentielle par centrifugation à 13 000 fois G pendant deux minutes à température ambiante. Après avoir lavé la palette de cellules avec un millilitre de PBS, remettez en suspension la palette bactérienne dans un millilitre de PBS. Déterminer les concentrations de suspension bactérienne en mesurant la densité optique à 600 nanomètres.Ensuite, pour tacher la suspension bactérienne, ajoutez deux microlitres du colorant de coloration vert ou rouge concentré 500 fois dans un millilitre de suspension bactérienne pour diluer le colorant d’un pli. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes avec une rotation douce dans l’obscurité. Après 30 minutes, centrifugez les bactéries colorées à 13 000 fois G pendant deux minutes et remettez la pastille dans un millilitre de PBS.Prélever les cellules bactériennes colorées par centrifugation à 13 000 fois G pendant deux minutes. Remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu F12 K frais et mesurez la densité optique de chaque culture à 600 nanomètres. Diluer ultérieurement les cultures aux concentrations souhaitées en fonction de la multiplicité de l’infection et de la concentration sur les cellules hôtes.Pour le test d’adhérence bactérienne, lavez trois fois les monocouches de cellules A549 précédemment cultivées en ajoutant 100 microlitres de PBS chaud à chaque puits et pipettez doucement de haut en bas. Ensuite, jetez PBS. Alternativement, après avoir ajouté PBS, attendez 10 secondes, puis retirez PBS à l’aide du vide.Pour déterminer la cinétique de l’association bactérienne, superposez les cellules avec 100 microlitres de concentrations souhaitées de suspension bactérienne avec différentes multiplicités d’infection. Faites tourner les bactéries et incubez les cellules A549 infectées à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure supplémentaire. Éliminez les bactéries non liées en lavant les monocouches cinq fois avec du PBS chaud, comme démontré.Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde à 4% dans tous les puits d’une plaque de 96 puits sur la glace. Après 15 minutes, lavez la plaque trois fois avec du PBS pour retirer la solution de fixation. Coloration dans les noyaux avec 50 nanogrammes par millilitre de tache DAPI pendant 10 minutes à température ambiante.Après avoir lavé les cellules avec du PBS, couvrez les cellules A549 infectées avec 100 microlitres de PBS pour éviter le séchage, puis stockez la plaque à quatre degrés Celsius jusqu’à deux jours dans l’obscurité ou procédez à l’imagerie. Pour maintenir l’intégrité des données, choisissez aléatoirement et manuellement cinq emplacements de chaque puits pour capturer les images à un grossissement de 20 fois. Capturez les images fluorescentes des bactéries sous les canaux GFP, les cellules A549 sous DAPI, et pour les bactéries colorées par le colorant fluorescent rouge, utilisez le canal PE Si cinq.Définissez les paramètres de la boule roulante pour le lissage et mesurez automatiquement la fonction d’étalement de points de la déconvolution de l’image en fonction de l’objectif d’obtenir une meilleure résolution. Mesurez l’intensité de fluorescence des cellules hôtes et des bactéries. Définissez l’intensité de fluorescence la plus faible des cellules hôtes et des bactéries comme seuils de comptage cellulaire et comptez toutes les bactéries proches d’une cellule hôte à une distance de 15 micromètres en tant que bactéries adhérentes.Une fois que les cellules ont été comptées à partir de toutes les images automatisées, analysez les lectures critiques, telles que le nombre de cellules hôtes, la taille et la forme des cellules, le nombre total de bactéries et le compte bactérien moyen par cellule hôte, qui est l’indicateur le plus important pour déterminer l’adhérence bactérienne. Après une heure de co-incubation, la souche PAO1 de Pseudomonas aeruginosa a adhéré aux cellules A549 en fonction de la dose. Des résultats similaires ont également été observés lorsque la bactérie à Gram positif listeria monocytogenes et son bacille subtilis de contrôle négatif.Une image représentative de la segmentation de P aeruginosa adhérente à l’hôte démontre la facilité de compter les cellules bactériennes à l’aide de ce protocole. Les résultats des analyses automatisées comprennent le nombre de bactéries et de cellules hôtes, le nombre moyen de bactéries par cellule hôte et la taille des cellules hôtes et les zones représentant l’état de santé des cellules hôtes, le niveau d’adhérence bactérienne et la cytotoxicité bactérienne. Outre les cellules A549, les HUVEC ont également été testés pour le test d’observance.Serratia rubidaea et streptococcus agalactiae adhéraient à HUVEC, mais pas aux cellules A549, et ce qui démontre la détection efficace et l’aptitude de plusieurs hôtes à étudier les interactions des bactéries hôtes à l’aide de cette méthode. Les cellules hôtes devraient atteindre environ 90 à 100% de confluence pour minimiser l’adhérence des bactéries indésirables au fond des puits. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer les nouveaux mécanismes, les interactions hôte-ravageur.

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