Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
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Wir danken Dr. Kaite Zlotkowski von Biotek Inc. für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium unter der Vertragsnummer W911NF1920013 an PdF, die Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) und das Innenministerium unter der Vertragsnummer 140D6319C0029 an PdF unterstützt. Der Inhalt der Informationen spiegelt nicht unbedingt die Position oder die Politik der Regierung wider, und es sollte keine offizielle Billigung abgeleitet werden.

1. A549 Zellkultur
<ol><li>Halten Sie die A549-Zelllinie in F-12K-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und inkubieren Sie bei 37 °C, 5%CO2.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage und passieren Sie es mit 85% -95% Konfluenz.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen kurz mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, sofern nicht anders angegeben) und behandeln Sie sie mit 1 ml 0,25% 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung (Untertauchen der Zellschicht) für etwa 2 min ...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Das Protokoll beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Aufzählung der bakteriellen Bindung an Wirtszellen. Der beschriebene Ansatz hat mehrere attraktive Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden. Erstens ermöglicht dieser Ansatz die genaue Quantifizierung der Anzahl der mikrobiellen Pathogenzellen, die an einzelne Wirtszellen gebunden sind. Wichtig ist, dass diese Quantifizierung ohne die Notwendigkeit einer mühsamen Bakterienernte, seriellen Verdünnung, Beschichtung auf festen Medien und Bestimmung der CFUs<su...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Bakterielle Adhäsion ist ein Prozess, bei dem sich Bakterien an andere Zellen oder Oberflächen anlagern. Die erfolgreiche Etablierung einer Infektion durch bakterielle Krankheitserreger erfordert die Adhäsion an Wirtszellen, die Besiedlung von Geweben und in einigen Fällen die Invasion von Wirtszellen1,2,3. Neu auftretende Infektionskrankheiten stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, wie die jüngste COVID-19-Pandemie4,5,6 zeigt. Wichtig ist, dass neue oder aufkommende Krankheitserreger mit genombasierten Ansätzen möglicherweise nicht ohne weiteres erkannt werden können, insbesondere in Fällen, in denen der Erreger so konstruiert wurde, dass er sich dem Nachweis entzieht oder keine genomischen Signaturen enthält, die ihn als pathogen identifizieren. Daher kann die Identifizierung potenzieller Krankheitserreger mit Methoden, die Kennzeichen der Pathogenität, wie die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen, direkt bewerten, eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Krankheitserregern spielen.
Bakterielle Adhärenz an Wirtszellen wird seit Jahrzehnten verwendet, um Mechanismen der bakteriellen Pathogenese zu bewerten1,7. Die mikroskopische Bildgebung8,9 und die Aufzählung der bakteriellen koloniebildenden Einheit (KBE)10 , 11,12,13 durch Post-Infektionsplattierung sind zwei gut entwickelte Labormethoden zur Prüfung der mikrobiellen Adhärenz und/oder Infektion von Wirtszellen14. In Anbetracht der Mikrometerskala von Bakterienzellen erfordert die Zählung der adhärenten Bakterienzellen im Allgemeinen den Einsatz fortschrittlicher Mikroskopietechniken mit hoher Vergrößerung sowie hochauflösender Bildgebungsansätze, einschließlich Elektronenmikroskopie, Expansionsmikroskopie (ExM)15,16und dreidimensionale Bildgebung17 . Alternativ kann die Zählung von Bakterien, die an Wirtszellen gebunden oder internalisiert sind, durchgeführt werden, indem die Verdünnungsreihe der geernteten Bakterien auf festes Agar plattiert und die resultierenden CFUs10,12,13gezählt werden. Diese Methode ist mühsam und umfasst viele manuelle Schritte, was Schwierigkeiten bei der Etablierung eines standardisierten oder automatisierten Verfahrens mit sich bringt, das für Hochdurchsatzanalysen erforderlich ist18,19. Daher würde die Entwicklung neuer Methoden zur Bewertung der Wirtszellbindung die derzeitigen Einschränkungen in diesem Bereich angehen.
Eine solche Methode wird hier beschrieben, die automatisierte Hochdurchsatzmikroskopie in Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse verwendet. Um den Ansatz zu demonstrieren, wurden Experimente mit mehreren bakteriellen Krankheitserregern durchgeführt, darunter Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger von Menschen, Tieren und Pflanzen14,20, der häufig die Atemwege von Patienten mit beeinträchtigten Wirtsabwehrfunktionen besiedelt. Dieser Ansatz optimierte den in früheren Studien14,20beschriebenen mikroskopischen Bildgebungsprozess. Der bildgebende Nachweis wurde durch fluoreszenzmarkierte Wirtszellen und Bakterien vereinfacht, um die Nähe von ihnen schnell zu verfolgen, was den Mikroskopieaufwand drastisch reduzierte, um hochauflösende Bilder zur Unterscheidung von Bakterien zu erhalten. Darüber hinaus ersetzte die automatisierte statistische Analyse von Bildern in zählenden Wirtszellen und Bakterien das praktische Experiment der bakteriellen CFU-Beschichtung, um das Verhältnis der adhärenten Bakterienzahlen pro Wirtszelle abzuschätzen. Um die Kompatibilität dieser Methode zu bestätigen, wurden auch mehrere Bakterienstämme und Wirtszelltypen wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae sowie menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) getestet, und die Ergebnisse unterstützen die Vielfalt und Wirksamkeit der Methode.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

Die Identifizierung neu auftretender bakterieller Krankheitserreger ist für die menschliche Gesundheit und Sicherheit von entscheidender Bedeutung. Die bakterielle Adhärenz an wirtszellen ist ein wesentlicher Schritt bei bakteriellen Infektionen und stellt ein Kennzeichen potenzieller Bedrohung dar. Daher kann die Untersuchung der Adhärenz von Bakterien an Wirtszellen als Bestandteil der bakteriellen Bedrohungsbewertung verwendet werden. Eine Standardmethode zur Aufzählung der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen besteht darin, Bakterien mit Wirtszellen zu inkubieren, die adhärenten Bakterien zu ernten, die geernteten Zellen auf festen Medien zu plattieren und dann die resultierenden koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Alternativ kann die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen bewertet werden. Herkömmliche Strategien zur Umsetzung dieser Ansätze sind jedoch zeitaufwendig und ineffizient. Hier wird ein kürzlich entwickeltes automatisiertes fluoreszenzmikroskopiebasiertes Bildgebungsverfahren beschrieben. In Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse ermöglicht die Methode eine schnelle Quantifizierung von Bakterien, die an Wirtszellen haften. Zwei Bakterienarten, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa und Gram-positive Listeria monocytogenes und entsprechende Negativkontrollen, wurden getestet, um das Protokoll zu demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz adhärente Bakterien schnell und genau aufzählt und experimentelle Arbeitsbelastungen und Zeitpläne signifikant reduziert.

Zur Entwicklung des fluoreszenzbildgebenden bakteriellen Adhärenztests wurden P. aeruginosa Stamm PAO1 und sein Negativadhärenz-Gegenstück E. coli verwendet, um die Wirksamkeit des Protokolls zu testen, da die Adhärenz dieser Bakterien an A549-Zellen berichtet worden war14,20,22. Zuerst wurden GFP-markierte P. aeruginosa (PAO1) und GFP-markierte E. coli mit einer humanen immortalisierten E...

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Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Diese Methode ermöglicht einen schnellen Hochdurchsatz-Nachweis der Bakterienadhärenz an Wirtszellen. Im Vergleich zu den herkömmlichen Beschichtungsmethoden reduziert es die praktische Zeit, die für die Quantifizierung der adhärenten Bakterien benötigt wird. Diese Technik ist automatisiert, zeitsparend und sehr reproduzierbar.Es ist auch weit verbreitet, sowohl auf die meisten Wirtszellen als auch auf die meisten Wirtszellen angewendet. Diese Methode ist sehr einfach. Für den ersten Versuch müssen die Bedingungen wie die Vielzahl der Infektionen und auch die Co-Inkubationszeit der Wirtsbakterien optimiert werden.Ernten Sie die Bakterienkulturen zunächst in einer exponentiellen Phase durch Zentrifugation bei 13.000 mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellenpalette mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, versenken Sie die Bakterienpalette in einem Milliliter PBS. Bestimmen Sie die Konzentrationen der Bakteriensuspension durch Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern.Dann, um die Bakteriensuspension zu färben, fügen Sie zwei Mikroliter des 500-fach konzentrierten brühigen grünen oder roten Färbefarbstoffs in einen Milliliter Bakteriensuspension hinzu, um den Farbstoff einfach zu verdünnen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten mit sanfter Rotation im Dunkeln. Nach 30 Minuten die gefärbten Bakterien bei 13.000 mal G für zwei Minuten zentrifugieren und das Pellet in einem Milliliter PBS resuspenieren.Sammeln Sie die gefärbten Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 13.000 mal G für zwei Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem F12 K-Medium und messen Sie die optische Dichte jeder Kultur bei 600 Nanometern. Anschließend verdünnen Sie die Kulturen auf die gewünschten Konzentrationen basierend auf der Vielzahl der Infektion und der Wirtszellkonzentration.Waschen Sie für den Bacterial Adherence Assay die zuvor kultivierten A549-Zellmonoschichten dreimal, indem Sie 100 Mikroliter warmes PBS in jede Vertiefung geben und vorsichtig auf und ab pipettieren. Verwerfen Sie dann PBS. Alternativ können Sie nach dem Hinzufügen von PBS 10 Sekunden warten und dann PBS mit Vakuum entfernen.Um die Kinetik der bakteriellen Assoziation zu bestimmen, überlagern Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern gewünschter Konzentrationen der Bakteriensuspension mit unterschiedlicher Vielzahl von Infektionen. Drehen Sie die Bakterien herunter und inkubieren Sie die infizierten A549-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine weitere Stunde. Entfernen Sie die ungebundenen Bakterien, indem Sie die Monoschichten fünfmal mit warmem PBS waschen, wie gezeigt.Als nächstes fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 4% Formaldehyd in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte auf dem Eis geben. Nach 15 Minuten waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, um die Fixierlösung zu entfernen. Färbung in den Kernen mit 50 Nanogramm pro Milliliter DAPI-Färbung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, bedecken Sie die infizierten A549-Zellen mit 100 Mikrolitern PBS, um ein Trocknen zu vermeiden, und lagern Sie die Platte dann bei vier Grad Celsius bis zu zwei Tage im Dunkeln oder fahren Sie mit der Bildgebung fort. Um die Datenintegrität zu erhalten, wählen Sie zufällig und manuell fünf Positionen jeder Vertiefung aus, um die Bilder mit der 20-fachen Vergrößerung aufzunehmen. Erfassen Sie die fluoreszierenden Bilder von Bakterien unter GFP-Kanälen, A549-Zellen unter DAPI und für die Bakterien, die mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt werden, verwenden Sie PE Si fünf Kanäle.Stellen Sie die Parameter des Rollballs für die Glättung ein und messen Sie automatisch die Punktspreizungsfunktion der Bilddekonvolution basierend auf dem Ziel, eine bessere Auflösung zu erreichen. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der Wirtszellen und Bakterien. Stellen Sie die schwächste Fluoreszenzintensität von Wirtszellen und Bakterien als Schwellenwerte für die Zellzahl ein und zählen Sie alle Bakterien, die in der Nähe einer Wirtszelle innerhalb von 15 Mikrometern Entfernung liegen, als Adhärenzbakterien.Sobald die Zellen aus allen automatisierten Bildern gezählt wurden, analysieren Sie kritische Messwerte wie Wirtszellzahlen, Zellgrößen und -formen, Gesamtbakterienzahlen und das durchschnittliche Bakterienkonto pro Wirtszelle, das der wichtigste Indikator für die Bestimmung der Bakterienadhärenz ist. Nach einer Stunde Co-Inkubation haftete der Pseudomonas aeruginosa-Stamm PAO1 dosisabhängig an A549-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei grampositiven Bakterien listeria monocytogenes und deren Negativkontrolle Bacillus subtilis beobachtet.Ein repräsentatives Bild der wirtsadhärenten P aeruginosa-Segmentierung zeigt die Leichtigkeit der Zählung von Bakterienzellen mit diesem Protokoll. Die Ergebnisse der automatisierten Analysen umfassen Bakterien- und Wirtszellzahlen, die durchschnittliche Keimzahl pro Wirtszelle und Wirtszellgrößen und -bereiche, die den Status der Wirtszellgesundheit darstellen, bakterielle Adhärenz und bakterielle Zytotoxizität. Neben A549-Zellen wurden HUVECs auch auf Adhärenztest getestet.Serratia rubidaea und Streptococcus agalactiae hafteten an HUVEC, aber nicht an A549-Zellen, was den effektiven Nachweis und die Eignung mehrerer Wirte zur Untersuchung der Wirtsbakterieninteraktionen mit dieser Methode zeigt. Wirtszellen sollten etwa 90 bis 100% Konfluenz erreichen, um die unerwünschten Bakterien, die am Boden der Vertiefungen haften, zu minimieren. Diese Technik wird es den Forschern ermöglichen, die neuen Mechanismen, die Wirt-Schädlings-Interaktionen, zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

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Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

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Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

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