Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

אנו מודים לד"ר קייט זלוטוקובסקי מ-Biotek Inc. על תמיכתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה תחת חוזה מספר W911NF1920013 ל- PdF, הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה (DARPA) ומשרד הפנים תחת חוזה מס '140D6319C0029 ל- PdF. תוכן המידע אינו משקף בהכרח את עמדת הממשלה או את מדיניותה, ואין להסיק כל אישור רשמי.

1. תרבית תאים A549
<ol><li>לשמור על קו התא A549 ב F-12K בינוני בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ודגרה ב 37 °C (5°F), 5% CO2.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל 3-4 ימים ועבר ב 85%-95% השפעה.</li>
	<li>בקצרה, לשטוף את התאים עם 1 x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4, אלא אם צוין אחרת) ולטפל עם 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין-0.53 mM חומצה אתילנדימי...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול מתאר גישה אוטומטית לספירת התקשרות חיידקית לתאים מארחים. לגישה המתוארת יש כמה יתרונות אטרקטיביים על פני שיטות קונבנציונליות. ראשית, גישה זו מאפשרת כימות מדויק של מספר תאי הפתוגן המיקרוביאליים המחוברים לתאים מארחים בודדים. חשוב לציין, כימות זה יכול להתבצע ללא צורך בקציר חיידקים ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

הידבקות חיידקית היא תהליך לפיו חיידקים מתחברים לתאים או למשטחים אחרים. הקמה מוצלחת של זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים דורשת הידבקות לתאים מארחים, קולוניזציה של רקמות, ובמקרים מסוימים, פלישה לתאים מארחים1,2,3. מחלות זיהומיות מתפתחות מהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, כפי שמעידת מגפת COVID-19 האחרונה4,5,6. חשוב לציין, פתוגנים חדשים או מתעוררים לא ניתן להבחין בקלות באמצעות גישות מבוססות גנומיות, במיוחד במקרים שבהם הפתוגן תוכנן להתחמק מזיהוי או אינו מכיל חתימות גנומיות המזהות אותו פתוגניים. לכן, זיהוי של פתוגנים פוטנציאליים באמצעות שיטות המעריכות ישירות סימני היכר של פתוגניות, כמו דבקות חיידקית בתאים מארחים, יכול לשחק תפקיד קריטי בזיהוי פתוגן.
דבקות חיידקית לתאים מארחים שימשה להערכת מנגנונים של פתוגנזה חיידקית במשךעשרות שנים 1,7. הדמיה מיקרוסקופית8,9 והספירה של יחידת יצירת מושבה חיידקית (CFU)10,11,12,13 על ידי ציפוי לאחר זיהום הן שתי שיטות מעבדה מפותחות לבדיקת דבקות מיקרוביאלית ו / או זיהום של תאים מארחים14. בהתחשב בגודל קנה המידה של תאי החיידקים, חלוקת תאי החיידקים החסידים דורשת בדרך כלל שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות בהגדלה גבוהה, כמו גם בגישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה הרחבה (ExM)15,16והדמיה תלת ממדית17 . לחלופין, ספירת חיידקים הקשורים או מופנמים בתוך תאים מארחים יכולה להתבצע על ידי ציפוי סדרת הדילול של חיידקים שנקטפו על אגר מוצק וספירת CFUs10,12,13. שיטה זו היא מייגע וכוללת צעדים ידניים רבים, אשר מציג קשיים בקביעת הליך סטנדרטי או אוטומטי הנדרש לניתוחים בעלי תפוקה גבוהה18,19. לכן, פיתוח שיטות חדשות להערכת קובץ מצורף לתא מארח יטפל במגבלות הנוכחיות בשדה.
שיטה אחת כזו מתוארת כאן המשתמשת במיקרוסקופיה אוטומטית של תפוקה גבוהה, בשילוב עם עיבוד תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי. כדי להדגים את הגישה, בוצעו ניסויים עם מספר פתוגנים חיידקיים, כולל פסאודומונס ארוגינוזה, פתוגן חיידקי גרם שלילי אופורטוניסטי של בני אדם, בעלי חיים וצמחים14,20, אשר נמצא לעתים קרובות ליישב את דרכי הנשימה של חולים עם תפקודי הגנה מארח לקוי. גישה זו מיטבה את תהליך ההדמיה המיקרוסקופית המתוארת במחקרים קודמים14,20. זיהוי ההדמיה היה פשוט יותר על ידי תאים מארחים ובקטריה המסומנים על ידי פלואורסצנטיות כדי לעקוב במהירות אחר הקרבה שלהם, מה שהפחית באופן דרמטי את עומס העבודה של המיקרוסקופיה כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה עבור חיידקים ייחודיים. בנוסף, הניתוח הסטטיסטי האוטומטי של תמונות בספירת תאים מארחים וחיידקים החליף את הניסוי הידני של ציפוי CFU חיידקי כדי להעריך את היחס בין ספירת חיידקים חסידים לתא מארח. כדי לאשר את התאימות של שיטה זו, זנים חיידקיים מרובים וסוגי תאים מארחים נבדקו גם, כמו ליסטריה מונוציטוגנים, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, ו Klebsiella דלקת ריאות, כמו גם תאי אנדותל וריד הטבור האנושי (HUVECs), והתוצאות תומכות במגוון וביעילות של השיטה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

זיהוי של פתוגנים חיידקיים מתעוררים הוא קריטי לבריאות וביטחון האדם. דבקות חיידקית בתאים מארחים היא צעד חיוני בזיהומים חיידקיים ומהווה סימן היכר של איום פוטנציאלי. לכן, בחינת דבקותם של חיידקים לתאים מארחים יכולה לשמש כמרכיב של הערכת איום חיידקי. שיטה סטנדרטית לספירת דבקות חיידקית לתאים מארחים היא להדגיר יחד חיידקים עם תאים מארחים, לקצור את החיידקים החסידים, צלחת התאים שנקטפו על מדיה מוצקה, ולאחר מכן לספור את המושבה שנוצרת יחידות יוצרות (CFU). לחלופין, דבקות חיידקית בתאים מארחים ניתן להעריך באמצעות גישות מבוססות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. עם זאת, אסטרטגיות קונבנציונליות ליישום גישות אלה גוזלות זמן ולא יעילות. כאן, פותחה לאחרונה שיטת הדמיה אוטומטית המבוססת על מיקרוסקופיה. בשילוב עם עיבוד תמונה בעל תפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי, השיטה מאפשרת כימות מהיר של חיידקים הנצמדים לתאים מארחים. שני מינים חיידקיים, פסאודומונס ארוגינוזה גרם-חיובי מונוציטוגנים ופקדים שליליים תואמים, נבדקו כדי להדגים את הפרוטוקול. התוצאות מראות כי גישה זו מהווה נדבך במהירות ובדייקנות ומצטרפת באופן משמעותי את עומסי העבודה וצירי הזמן הניסיוניים.

כדי לפתח את בדיקת דבקות חיידקית מבוססת הדמיית פלואורסצנטיות, זן P. aeruginosa PAO1 ומקבילו לדבקות שלילית E. coli שימשו לבדיקת יעילות הפרוטוקול, כמו הדבקות של חיידקים אלה לתאי A549 דווח14,20,22. ראשית, GFP - שכותרתו P. aeruginosa (PAO1) ו- GFP שכותרתו E. ...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

שיטה זו מספקת זיהוי מהיר, תפוקה גבוהה של דבקות חיידקים לתאים מארחים. בהשוואה לשיטות ה ציפוי הקונבנציונליות, זה להפחית את הזמן הידיים על הנדרש לכימות של חיידקים דבקים. טכניקה זו היא אוטומטית, חוסכת זמן ו ניתנת לשחזור רב.זה גם מיושם באופן נרחב הן על רוב התאים המארחים. שיטה זו, יש מאוד פשוטה. לניסוי הראשון, יש אופטימיזציה של התנאים כמו ריבוי הזיהום, וגם זמן הדגירה המשותפת של החיידקים המארחים.ראשית לקצור את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת משטח התאים עם PBS מיליליטר אחד, resuspend פלטת החיידקים ב PBS מיליליטר אחד. לקבוע את הריכוזים של השעיה חיידקית על ידי מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר.לאחר מכן, להכתמת ההשעיה החיידקית, הוסיפו שני מיקרוליטרים של צבע הכתמים המרוכז של 500 המניות הירוק או האדום למיליליטר אחד של השעיית חיידקים כדי לדלל את הצבע קיפול אחד. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה החיידקים המוכתמים ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות ו resuspened הכדור במיליליטר אחד של PBS.לאסוף את תאי החיידקים מוכתמים על ידי צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות. resuspend הכדור במיליליטר אחד של בינוני F12 K טרי ולמדוד את הצפיפות האופטית של כל תרבות ב 600 ננומטר. לאחר מכן לדלל את התרבויות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום וריכוז התא המארח.עבור דבקות חיידקית Assay, לשטוף את שכבות מונו תא A549 בתרבית בעבר שלוש פעמים על ידי הוספת 100 microliters של PBS חם לכל באר בעדינות pipette למעלה ולמטה. לאחר מכן השלך PBS. לחלופין, לאחר הוספת PBS, המתן 10 שניות ולאחר מכן הסר PBS באמצעות ואקום.כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, לכסות את התאים עם 100 microliters של ריכוזים הרצויים של השעיה חיידקית עם ריבוי שונה של זיהום. לסובב את החיידקים ולדגירה את תאי A549 נגועים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת נוספת. הסר את החיידקים הלא מאוגדים על ידי שטיפת שכבות מונו חמש פעמים עם PBS חם כפי שהוכח.לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 4% פורמלדהיד בכל הבארות של צלחת 96 באר על הקרח. לאחר 15 דקות, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את פתרון הקיבעון. כתם בגרעינים עם 50 ננוגרם למיליליטר כתם DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפת התאים עם PBS, לכסות את תאי A549 נגועים עם 100 microliters של PBS כדי למנוע ייבוש ולאחר מכן לאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד יומיים בחושך או להמשיך להדמיה. כדי לשמור על שלמות הנתונים, בחר באופן אקראי ובאופן ידני חמישה מיקומים של כל באר כדי ללכוד את התמונות בהגדלה של פי 20. ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות של חיידקים תחת ערוצי GFP, תאי A549 תחת DAPI, ועל החיידקים מוכתמים על ידי צבע פלואורסצנטי אדום להשתמש PE Si חמש ערוץ.הגדר את הפרמטרים של הכדור המתגלגל להחלקת ומדוד אוטומטית את פונקציית התפשטות הנקודות של דה-וולוציה של תמונה בהתבסס על המטרה להשגת רזולוציה טובה יותר. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים המארחים והחיידקים. הגדר את עוצמת הפלואורסצנטיות החלשה ביותר של תאים מארחים וחיידקים כסף לספירת התאים וספור את כל החיידקים הקרובים לתא מארח במרחק של 15 מיקרומטר כחיידק הדבקות.לאחר שהתאים נספרו מכל התמונות האוטומטיות, ניתחו קריאות קריטיות, כגון ספירת תאים מארחים, גדלי תאים וצורות, ספירת חיידקים כוללת וחשבון חיידקי ממוצע לכל תא מארח, שהוא האינדיקטור החשוב ביותר לקביעת דבקות חיידקית. לאחר שעה אחת של דגירה משותפת, פסאודומונס aeruginosa זן PAO1 דבק בתאי A549 בצורה תלויה במינון. תוצאות דומות נצפו גם כאשר חיידקים חיוביים גרם ליסטריה monocytogenes ואת השליטה השלילית שלה bacillus subtilis.תמונה מייצגת של פילוח P aeruginosa חסיד מארח מדגימה את הקלות של ספירת תאים חיידקיים באמצעות פרוטוקול זה. התוצאות של הניתוחים האוטומטיים כוללות ספירת תאים חיידקיים וארחים, ספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח וגדלי תאים מארחים ואזורים המייצגים את מצב בריאות התא המארח, רמת הדבקות החיידקית ורעילות ציטו חיידקית. מלבד תאי A549, HUVECs נבדקו גם לבדיקת דבקות.Serratia rubidaea ו streptococcus agalactiae היו דבקים HUVEC, אבל לא לתאי A549, אשר מדגים את הזיהוי היעיל ואת ההתאמה של מארחים מרובים ללמוד את אינטראקציות חיידקים המארחים באמצעות שיטה זו. תאים מארחים צריכים להגיע סביב 90 עד 100% מפגש כדי למזער את דבקות החיידקים הבלתי רצויים בתחתית בארות. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנונים החדשים, אינטראקציות המזיקים המארחים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...