Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
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हम बायोटेक इंक के डॉ काइट Zlotkowski उनके तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं । इस काम को रक्षा विभाग द्वारा अनुबंध संख्या W911NF1920013 के तहत पीडीएफ, डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA) और अनुबंध संख्या 140D6319C029 के तहत आंतरिक विभाग द्वारा पीडीएफ को समर्थन दिया गया था। सूचना की विषयवस्तु सरकार की स्थिति या नीति को आवश्यक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती है और किसी आधिकारिक समर्थन का अनुमान नहीं लगाया जाना चाहिए ।

1. A549 सेल संस्कृति
<ol><li>एफ-12K माध्यम में A549 सेल लाइन को बनाए रखें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट।</li>
	<li>हर 3-4 दिन में माध्यम बदलें और 85%-95% की मंजूरी पर पारित करे...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

प्रोटोकॉल मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु लगाव की गणना के लिए एक स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन करता है । वर्णित दृष्टिकोण पारंपरिक तरीकों पर कई आकर्षक लाभ है। सबसे पहले, यह दृष्टिकोण माइक्रोबियल रोगजनक ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

बैक्टीरियल आसंजन एक प्रक्रिया है जिससे बैक्टीरिया अन्य कोशिकाओं या सतहों से जुड़ते हैं। जीवाणु रोगजनकों द्वारा संक्रमण की सफल स्थापना के लिए कोशिकाओं की मेजबानी करने, ऊतकों के उपनिवेशीकरण और कुछ मामलों में, मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण1,2,3की आवश्यकता होती है। उभरते संक्रामक रोग प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरों का गठन करते हैं, जैसा कि हाल ही में COVID-19 महामारी4,5,6से सबूत है। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीनोमिक-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके नए या उभरते रोगजनकों को आसानी से नहीं समझा जा सकता है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां रोगजनक को पता लगाने से बचने के लिए इंजीनियर किया गया है या इसमें जीनोमिक हस्ताक्षर नहीं होते हैं जो इसे रोगजनक के रूप में पहचानते हैं। इसलिए, संभावित रोगजनकों की पहचान उन तरीकों का उपयोग करके जो सीधे रोगजनकता की पहचान का आकलन करते हैं, जैसे मेजबान कोशिकाओं के बैक्टीरियल पालन, रोगजनक पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।
1,7दशकों तक जीवाणु रोगजनकता के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए मेजबान कोशिकाओं का जीवाणु पालन कियाजाता रहाहै . माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग8,9 और बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने वाली इकाई(सीएफयू) 10, 11,12,13 की गणना पोस्ट-इंफेक्शन प्लेटिंग द्वारा माइक्रोबियल पालन और/या मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के परीक्षण के लिए दो अच्छी तरह से विकसित प्रयोगशाला विधियां हैं14। बैक्टीरियल कोशिकाओं के माइक्रोमीटर पैमाने के आकार को ध्यान में रखते हुए, अनुयायी बैक्टीरियल कोशिकाओं की गणना के लिए आम तौर पर उन्नत उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है, साथ ही इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM)15,16,और त्रि-आयामी इमेजिंग17 सहित उच्च-संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण . वैकल्पिक रूप से, मेजबान कोशिकाओं के भीतर बंधे या आंतरिक बैक्टीरिया की गणना ठोस आगार पर काटे गए बैक्टीरिया की कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला को चढ़ाना और परिणामीसीएफयू 10 , 12,13की गणना करके किया जा सकता है। यह विधि श्रमसाध्य है और इसमें कई मैनुअल चरण शामिल हैं, जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण18, 19के लिए आवश्यक मानकीकृत या स्वचालित प्रक्रियास्थापितकरने में कठिनाइयों का परिचय देते हैं। इसलिए, मेजबान सेल लगाव के मूल्यांकन के लिए नए तरीकों के विकास क्षेत्र में वर्तमान सीमाओं को संबोधित करेंगे ।
ऐसी ही एक विधि यहां वर्णित है जो स्वचालित उच्च थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करती है, जो उच्च थ्रूपुट छवि प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ संयुक्त है। दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, कई जीवाणु रोगजनकों के साथ प्रयोग किए गए थे, जिनमें स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,मनुष्यों, जानवरों और पौधों के एक अवसरवादी ग्राम-नकारात्मक जीवाणु रोगजनक14,20शामिल थे, जो अक्सर बिगड़ा मेजबान रक्षा कार्यों वाले रोगियों के श्वसन तंत्र को उपनिवेश बनाने के लिए पाया जाता है। इस दृष्टिकोण ने पिछले अध्ययनों में वर्णित सूक्ष्म इमेजिंग प्रक्रिया को अनुकूलित किया14,20. इमेजिंग डिटेक्शन को फ्लोरेसेंस-लेबल वाली मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया द्वारा सरल बनाया गया था ताकि उनकी निकटता को तेजी से ट्रैक किया जा सके, जिसने बैक्टीरिया को भेदने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी कार्यभार को नाटकीय रूप से कम कर दिया। इसके अलावा, मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की गिनती में छवियों के स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण ने प्रति मेजबान कोशिका के पालनीय बैक्टीरियल काउंट के अनुपात का अनुमान लगाने के लिए बैक्टीरियल सीएलयू प्लेटिंग के हाथ से प्रयोग को बदल दिया। इस विधि की अनुकूलता की पुष्टि करने के लिए, कई बैक्टीरियल उपभेदों और मेजबान सेल प्रकारों का भी परीक्षण किया गया है, जैसे लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, बैसिलस सेरियस, और क्लेबसिएला निमोनिया, साथ ही मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) की तरह, और परिणाम विधि की विविधता और प्रभावशीलता का समर्थन करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

उभरते जीवाणु रोगजनकों की पहचान मानव स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु पालन जीवाणु संक्रमण में एक आवश्यक कदम है और संभावित खतरे की एक बानगी का गठन किया । इसलिए, कोशिकाओं की मेजबानी के लिए बैक्टीरिया के पालन की जांच बैक्टीरिया खतरे के आकलन के एक घटक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु पालन की गणना के लिए एक मानक विधि मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया को सह-इनक्यूबेट करना, अनुयायी बैक्टीरिया को फसल करना, ठोस मीडिया पर काटा गया कोशिकाओं को प्लेट करना, और फिर परिणामी कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीआईएफयू) को गिनना है। वैकल्पिक रूप से, मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु पालन का मूल्यांकन इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों को लागू करने के लिए पारंपरिक रणनीतियां समय लेने वाली और अक्षम हैं । यहां, हाल ही में विकसित स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित इमेजिंग विधि का वर्णन किया गया है। जब उच्च थ्रूपुट छवि प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जाता है, तो विधि मेजबान कोशिकाओं का पालन करने वाले बैक्टीरिया के तेजी से मात्राकरण को सक्षम बनाती है। प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए दो जीवाणु प्रजातियों, ग्राम-नकारात्मक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और ग्राम-सकारात्मक लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन और इसी नकारात्मक नियंत्रण का परीक्षण किया गया । परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण तेजी से और सही रूप से अनुयायी बैक्टीरिया की गणना करता है और प्रयोगात्मक वर्कलोड और समयसीमा को काफी कम कर देता है।

फ्लोरेसेंस इमेजिंग आधारित बैक्टीरियल पालन परख विकसित करने के लिए, पी एरुगिनोसा तनाव PAO1 और उसके नकारात्मक पालन समकक्ष ई. कोलाई का उपयोग प्रोटोकॉल प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए किया गया था, क...

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Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण विधियों के साथ-साथ उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस लेबलिंग इमेजिंग का उपयोग करके फेनोटाइपिक पालन के आधार पर मेजबान-बैक्टीरियल रोगजनक इंटरैक्शन का पता लगाना मेजबान कोशिकाओं के साथ संभावित बैक्टीरियल इंटरैक्शन का तेजी से मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है।

होस्ट कोशिकाओं के लिए बैक्टीरियल पालन का स्वचालित, उच्च थ्रूपुट डिटेक्शन

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

यह विधि मेजबान कोशिकाओं के बैक्टीरिया पालन का एक तेजी से, उच्च थ्रूपुट का पता लगाने प्रदान करती है। पारंपरिक चढ़ाना तरीकों की तुलना में, यह अनुयायी बैक्टीरिया की मात्रा के लिए आवश्यक हाथ पर समय को कम । यह तकनीक स्वचालित, समय की बचत और बहुत प्रजनन योग्य है।यह भी एक व्यापक रूप से मेजबान कोशिकाओं के अधिकांश के लिए दोनों लागू किया । यह विधि, बहुत सीधी है। पहले परीक्षण के लिए, संक्रमण की बहुलता जैसी स्थितियों, और मेजबान बैक्टीरिया सह-इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए।पहले कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए 13, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा एक घातीय चरण में जीवाणु संस्कृतियों फसल । कोशिकाओं को एक मिलीलीटर पीबीएस के साथ फूस धोने के बाद, एक मिलीलीटर पीबीएस में बैक्टीरियल पैलेट को फिर से खर्च करें। 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा बैक्टीरियल निलंबन की सांद्रता निर्धारित करें।फिर, बैक्टीरियल निलंबन को धुंधला करने के लिए, डाई को एक गुना पतला करने के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन के एक मिलीलीटर में 500 गुना केंद्रित स्टॉक हरे या लाल धुंधला डाई के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। अंधेरे में कोमल रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 30 मिनट के बाद, दो मिनट के लिए 13, 000 बार जी पर दाग बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र और पीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।दो मिनट के लिए 13, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा दाग बैक्टीरियल कोशिकाओं को ले लीजिए। ताजा F12 K माध्यम के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें और 600 नैनोमीटर पर प्रत्येक संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। बाद में संक्रमण और मेजबान सेल एकाग्रता की बहुलता के आधार पर वांछित सांद्रता के लिए संस्कृतियों को कमजोर।बैक्टीरियल पालन परख के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर पहले सुसंस्कृत A549 सेल मोनो परतों को तीन बार धोएं और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। इसके बाद पीबीएस को छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से, पीबीएस जोड़ने के बाद, 10 सेकंड तक प्रतीक्षा करें और फिर वैक्यूम का उपयोग करके पीबीएस को हटा दें।बैक्टीरियल एसोसिएशन की गतिज निर्धारित करने के लिए, संक्रमण की विभिन्न बहुलता के साथ बैक्टीरियल निलंबन की वांछित सांद्रता के 100 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को ओवरले करें। बैक्टीरिया को नीचे स्पिन करें और संक्रमित A549 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड को अतिरिक्त एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रदर्शन के रूप में गर्म PBS के साथ पांच बार मोनो परतों को धोने के द्वारा अनबाउंड बैक्टीरिया को हटा दें ।इसके बाद, बर्फ पर 96 अच्छी प्लेट के सभी कुओं में 4% फॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। 15 मिनट के बाद, फिक्सेशन समाधान को हटाने के लिए प्लेट को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 50 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर DAPI दाग के साथ नाभिक में दाग।पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, पीबीएस के १०० माइक्रोलीटर के साथ संक्रमित A549 कोशिकाओं को कवर करने के लिए सुखाने से बचने के लिए और फिर अंधेरे में दो दिनों तक के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान या इमेजिंग के लिए आगे बढ़ना । डेटा अखंडता को बनाए रखने के लिए, बेतरतीब ढंग से और मैन्युअल रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से पांच स्थानों को लेने के लिए 20 बार आवर्धन पर छवियों पर कब्जा । जीएफपी चैनलों के तहत बैक्टीरिया की फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा, DAPI के तहत A549 कोशिकाओं, और लाल फ्लोरोसेंट डाई द्वारा दाग बैक्टीरिया के लिए पीई सी पांच चैनल का उपयोग करें ।बेहतर संकल्प प्राप्त करने के उद्देश्य के आधार पर छवि विखेपन के बिंदु प्रसार कार्य को चौरसाई और ऑटो मापने के लिए रोलिंग बॉल के मापदंडों को निर्धारित करें। मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। सेल काउंट के लिए थ्रेसहोल्ड के रूप में मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की सबसे कमजोर फ्लोरेसेंस तीव्रता निर्धारित करें और पालन बैक्टीरिया के रूप में 15 माइक्रोमीटर दूरी के भीतर एक मेजबान कोशिका के लिए सभी बैक्टीरिया समीपस्थ गिनती करें।एक बार कोशिकाओं को सभी स्वचालित छवियों से गिना गया है, ऐसे मेजबान सेल मायने रखता है, सेल आकार और आकार, कुल जीवाणु मायने रखता है, और मेजबान सेल है, जो सबसे महत्वपूर्ण संकेतक है प्रति मेजबान सेल, के रूप में महत्वपूर्ण readouts का विश्लेषण । सह इनक्यूबेशन के एक घंटे के बाद, स्यूडोमोनास एयरोगिनोसा तनाव PAO1 एक खुराक निर्भर फैशन में A549 कोशिकाओं का पालन किया । इसी तरह के परिणाम तब भी देखे गए जब ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन और इसके नकारात्मक नियंत्रण बैसिलस उपटिलिस ।मेजबान अनुयायी पी एरुगिनोसा विभाजन की एक प्रतिनिधि छवि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके बैक्टीरियल कोशिकाओं की गिनती करने में आसानी को दर्शाती है। स्वचालित विश्लेषणों के परिणामों में बैक्टीरियल और होस्ट सेल मायने रखता है, प्रति मेजबान सेल और मेजबान सेल आकार और मेजबान सेल स्वास्थ्य, बैक्टीरियल पालन स्तर और बैक्टीरियल साइटो विषाक्तता की स्थिति का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्रों में औसत बैक्टीरियल मायने रखता है। A549 कोशिकाओं के अलावा, HUVECs भी पालन परख के लिए परीक्षण किया गया ।सेरेशिया रूबिडिया और स्ट्रेप्टोकोकस एगलेक्टिया एचयूवीईसी के अनुयायी थे, लेकिन A549 कोशिकाओं के लिए नहीं, और जो इस विधि का उपयोग करके मेजबान बैक्टीरिया इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कई मेजबानों की प्रभावी पहचान और उपयुक्तता को दर्शाता है। मेजबान कोशिकाओं को कुओं के नीचे अवांछनीय बैक्टीरिया पालन को कम करने के लिए लगभग ९० से १००% संगम तक पहुंचना चाहिए । इस तकनीक से शोधकर्ताओं को नए तंत्र, मेजबान कीट बातचीत का पता लगाने की अनुमति मिलेगी ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

मात्रात्मक उच्च throughput टी कोशिकाओं के लिए एकल कक्ष cytotoxicity परख

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

होस्ट में शामिल कारक के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित assays<em&gt; ब्रूसिला</em&gt; हेला कोशिकाओं के संक्रमण

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

एक पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली के कार्यान्वयन के स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./शिगेला एसपीपी.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में क्षमता को फिर से सील प्लाज्मा झिल्ली का उच्च प्रवाह माप

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

सेलुलर और जैविक स्तर के मेजबान प्रतिक्रियाओं के लिए जांच करने के लिए एक जीवाणु रोगज़नक़ का उपयोग करना

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

एक उच्च थ्र्रपुट शिगेला-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

बैक्टीरियल हठ पर उनके प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक यौगिकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...