Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
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Siamo grati al Dr. Kaite Zlotkowski di Biotek Inc. per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Difesa con il numero di contratto W911NF1920013 a PdF, dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dal Dipartimento degli Interni con contratto n. 140D6319C0029 a PdF. Il contenuto delle informazioni non riflette necessariamente la posizione o la politica del governo e non dovrebbe essere dedotto alcun avallo ufficiale.

1. Coltura cellulare A549
<ol><li>Mantenere la linea cellulare A549 in mezzo F-12K integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e incubare a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni e passare all'85% -95% di confluenza.</li>
	<li>Brevemente, sciacquare le cellule con 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, se non diversamente indicato) e trattare con 1 ml di 0,25% di tripsina-0,53 mM soluzione di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) (immergendo lo strato cellulare) pe...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Il protocollo descrive un approccio automatizzato per enumerare l'attaccamento batterico alle cellule ospiti. L'approccio descritto presenta diversi vantaggi interessanti rispetto ai metodi convenzionali. In primo luogo, questo approccio consente la quantificazione precisa del numero di cellule patogene microbiche che sono attaccate alle singole cellule ospiti. È importante sottolineare che questa quantificazione può essere eseguita senza la necessità di laboriose raccolte batteriche, diluizioni seriali, placcatura su...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

L'adesione batterica è un processo in cui i batteri si attaccano ad altre cellule o superfici. L'instaurazione di successo dell'infezione da parte di agenti patogeni batterici richiede l'adesione alle cellule ospiti, la colonizzazione dei tessuti e, in alcuni casi, l'invasione delle cellule ospiti1,2,3. Le malattie infettive emergenti costituiscono gravi minacce per la salute pubblica, come evidenziato dalla recente pandemia di COVID-194,5,6. È importante sottolineare che i patogeni nuovi o emergenti potrebbero non essere facilmente individuati utilizzando approcci basati sulla genomica, specialmente nei casi in cui l'agente patogeno è stato progettato per eludere il rilevamento o non contiene firme genomiche che lo identificano come patogeno. Pertanto, l'identificazione di potenziali agenti patogeni utilizzando metodi che valutano direttamente i segni distintivi della patogenicità, come l'aderenza batterica alle cellule ospiti, può svolgere un ruolo critico nell'identificazione dei patogeni.
L'aderenza batterica alle cellule ospiti è stata utilizzata per valutare i meccanismi di patogenesi batterica per decenni1,7. L'imaging microscopico8,9 e l'enumerazione dell'unità di formazione di colonie batteriche (CFU)10,11,12,13 mediante placcatura post-infezione sono due metodi di laboratorio ben sviluppati per testare l'aderenza microbica e/o l'infezione delle cellule ospiti14. Considerando la dimensione della scala micrometrica delle cellule batteriche, l'enumerazione delle cellule batteriche aderenti richiede generalmente l'uso di tecniche avanzate di microscopia ad alto ingrandimento, nonché approcci di imaging ad alta risoluzione, tra cui microscopia elettronica, microscopia ad espansione (ExM)15,16e imaging tridimensionale17 . In alternativa, l'enumerazione dei batteri legati o internalizzati all'interno delle cellule ospiti può essere eseguita placcando la serie di diluizione dei batteri raccolti su agar solido e contando le CFU risultanti10,12,13. Questo metodo è laborioso e include molti passaggi manuali, che introduce difficoltà nello stabilire una procedura standardizzata o automatizzata richiesta per le analisi ad alto rendimento18,19. Pertanto, lo sviluppo di nuovi metodi per valutare l'attaccamento delle cellule ospiti affronterebbe le attuali limitazioni nel campo.
Uno di questi metodi è descritto qui che utilizza la microscopia automatizzata ad alto throughput, combinata con l'elaborazione delle immagini ad alto throughput e l'analisi statistica. Per dimostrare l'approccio, sono stati eseguiti esperimenti con diversi patogeni batterici, tra cui Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico di esseri umani, animali e piante14,20, che si trova spesso a colonizzare il tratto respiratorio di pazienti con funzioni di difesa dell'ospite compromesse. Questo approccio ha ottimizzato il processo di imaging microscopico descritto in precedenti studi14,20. Il rilevamento dell'imaging è stato semplificato da cellule ospiti e batteri marcati con fluorescenza per tracciare rapidamente la vicinanza di essi, il che ha ridotto drasticamente il carico di lavoro della microscopia per ottenere immagini ad alta risoluzione per distinguere i batteri. Inoltre, l'analisi statistica automatizzata delle immagini nel conteggio delle cellule ospiti e dei batteri ha sostituito l'esperimento pratico di placcatura CFU batterica per stimare il rapporto tra conta batterica aderente per cellula ospite. Per confermare la compatibilità di questo metodo, sono stati testati anche più ceppi batterici e tipi di cellule ospiti, come Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, così come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), e i risultati supportano la diversità e l'efficacia del metodo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

L'identificazione di patogeni batterici emergenti è fondamentale per la salute e la sicurezza umana. L'aderenza batterica alle cellule ospiti è un passo essenziale nelle infezioni batteriche e costituisce un segno distintivo di potenziale minaccia. Pertanto, l'esame dell'aderenza dei batteri alle cellule ospiti può essere utilizzato come componente della valutazione della minaccia batterica. Un metodo standard per enumerare l'aderenza batterica alle cellule ospiti è quello di co-incubare i batteri con le cellule ospiti, raccogliere i batteri aderenti, placcare le cellule raccolte su mezzi solidi e quindi contare le unità formanti colonie risultanti (CFU). In alternativa, l'aderenza batterica alle cellule ospiti può essere valutata utilizzando approcci basati sulla microscopia a immunofluorescenza. Tuttavia, le strategie convenzionali per l'attuazione di questi approcci richiedono molto tempo e sono inefficienti. Qui viene descritto un metodo di imaging automatizzato basato sulla microscopia a fluorescenza sviluppato di recente. Se combinato con l'elaborazione delle immagini ad alto rendimento e l'analisi statistica, il metodo consente una rapida quantificazione dei batteri che aderiscono alle cellule ospiti. Due specie batteriche, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa e Gram-positive Listeria monocytogenes e corrispondenti controlli negativi, sono state testate per dimostrare il protocollo. I risultati mostrano che questo approccio enumera rapidamente e accuratamente i batteri aderenti e riduce significativamente i carichi di lavoro e le tempistiche sperimentali.

Per sviluppare il test di aderenza batterica basato sull'imaging a fluorescenza, P. aeruginosa ceppo PAO1 e la sua controparte ad aderenza negativa E. coli sono stati utilizzati per testare l'efficacia del protocollo, poiché l'aderenza di questi batteri alle cellule A549 era stata riportata14,20,22. In primo luogo, P. aeruginosa (PAO1) marcata GFP e E. coli marcata GFP sono state co-incubate ...

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Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull'aderenza fenotipica utilizzando l'imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Questo metodo fornisce un rilevamento rapido e ad alto rendimento dell'aderenza dei batteri alle cellule ospiti. Rispetto ai metodi di placcatura convenzionali, riduce il tempo pratico necessario per la quantificazione dei batteri aderenti. Questa tecnica è automatizzata, fa risparmiare tempo e molto riproducibile.È anche ampiamente applicato sia alla maggior parte delle cellule ospiti. Questo metodo, c'è molto semplice. Per il primo studio, le condizioni come la molteplicità dell'infezione e anche il tempo di co-incubazione dei batteri ospiti devono essere ottimizzati.Per prima cosa raccogliere le colture batteriche in fase esponenziale mediante centrifugazione a 13.000 volte G per due minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato il pallet di celle con un MILLILITRO PBS, risospesere la tavolozza batterica in un millilitro PBS. Determinare le concentrazioni di sospensione batterica misurando la densità ottica a 600 nanometri.Quindi, per colorare la sospensione batterica, aggiungere due microlitri del colorante colorante colorante verde o rosso concentrato 500 volte in un millilitro di sospensione batterica per diluire il colorante una piega. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti con una leggera rotazione al buio. Dopo 30 minuti, centrifugare i batteri colorati a 13.000 volte G per due minuti e risospescere il pellet in un millilitro di PBS.Raccogliere le cellule batteriche colorate mediante centrifugazione a 13.000 volte G per due minuti. Risospesare il pellet in un millilitro di mezzo fresco F12 K e misurare la densità ottica di ciascuna coltura a 600 nanometri. Successivamente diluire le colture alle concentrazioni desiderate in base alla molteplicità dell'infezione e della concentrazione della cellula ospite.Per il test di aderenza batterica, lavare tre volte gli strati monocellulari A549 precedentemente coltivati aggiungendo 100 microlitri di PBS caldo a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente su e giù. Quindi scartare PBS. In alternativa, dopo aver aggiunto PBS, attendere 10 secondi e quindi rimuovere PBS utilizzando il vuoto.Per determinare la cinetica dell'associazione batterica, sovrapporre le cellule con 100 microlitri delle concentrazioni desiderate di sospensione batterica con diverse molteplicità di infezione. Spin down i batteri e incubare le cellule A549 infette a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ulteriore ora. Rimuovere i batteri non legati lavando gli strati mono cinque volte con PBS caldo come dimostrato.Quindi, fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di formaldeide al 4% in tutti i pozzetti di una piastra da 96 pozzi sul ghiaccio. Dopo 15 minuti, lavare la piastra tre volte con PBS per rimuovere la soluzione di fissaggio. Colorazione nei nuclei con 50 nanogrammi per millilitro di colorazione DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente.Dopo aver lavato le cellule con PBS, coprire le cellule A549 infette con 100 microlitri di PBS per evitare l'essiccazione e quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di due giorni al buio o procedere per l'imaging. Per mantenere l'integrità dei dati, scegli in modo casuale e manuale cinque posizioni di ciascun pozzo per acquisire le immagini con un ingrandimento di 20 volte. Cattura le immagini fluorescenti dei batteri sotto i canali GFP, le cellule A549 sotto DAPI e per i batteri macchiati dal colorante fluorescente rosso usa PE Si cinque canali.Impostare i parametri della palla rotante per la levigatura e misurare automaticamente la funzione di diffusione del punto della deconvoluzione dell'immagine in base all'obiettivo di ottenere una risoluzione migliore. Misurare l'intensità di fluorescenza delle cellule ospiti e dei batteri. Impostare l'intensità di fluorescenza più debole delle cellule ospiti e dei batteri come soglie per il conteggio cellulare e contare tutti i batteri vicini a una cellula ospite entro 15 micrometri di distanza come batteri di aderenza.Una volta che le cellule sono state contate da tutte le immagini automatizzate, analizzare le letture critiche, come i conteggi delle cellule ospiti, le dimensioni e le forme delle cellule, le conteggie batteriche totali e il conto batterico medio per cellula ospite, che è l'indicatore più importante per determinare l'aderenza batterica. Dopo un'ora di co-incubazione, pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1 ha aderito alle cellule A549 in modo dose-dipendente. Risultati simili sono stati osservati anche quando i batteri gram-positivi listeria monocytogenes e il suo controllo negativo bacillus subtilis.Un'immagine rappresentativa della segmentazione dell'aeruginosa P aderente all'ospite dimostra la facilità di contare le cellule batteriche utilizzando questo protocollo. I risultati delle analisi automatizzate includono la conta batterica e delle cellule ospiti, la conta batterica media per cellula ospite e le dimensioni e le aree delle cellule ospiti che rappresentano lo stato di salute delle cellule ospiti, il livello di aderenza batterica e la tossicità citossicità batterica. Oltre alle cellule A549, gli HUVEC sono stati testati anche per il test di aderenza.Serratia rubidaea e streptococcus agalactiae erano aderenti a HUVEC, ma non alle cellule A549, e ciò dimostra l'efficace rilevamento e l'idoneità di più ospiti a studiare le interazioni dei batteri ospiti utilizzando questo metodo. Le cellule ospiti dovrebbero raggiungere circa il 90-100% di confluenza per ridurre al minimo l'aderenza dei batteri indesiderati al fondo dei pozzetti. Questa tecnica permetterà ai ricercatori di esplorare i nuovi meccanismi, le interazioni ospite-parassita.

Research

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