Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
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우리는 Biotek Inc.의 카이테 즐로코프스키 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 PdF에 계약 번호 W911NF1920013에 따라 국방부에 의해 지원되었다, 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA), 그리고 계약에 따라 내무부 140D6319 C0029 PdF에. 정보의 내용은 반드시 정부의 입장이나 정책을 반영하지 않으며, 공식적인 보증을 유추해서는 안됩니다.

1. A549 세포 배양
<ol><li>F-12K 배지에서 A549 세포주를 유지하여 10% 태아소 혈청(FBS)으로 보충하고 37°C, 5%CO2에서배양한다.</li>
	<li>매 3-4 일마다 매체를 변경하고 85 %-95 %의 합류로 통과합니다.</li>
	<li>간략하게, 1 x 인산염 완충식식염(PBS, pH 7.4, 달리 명시되지 않는 한)으로 세포를 헹구고 1 ml의 0.25% 트립신-0.53 mM 에틸렌디아민트라아세산(EDTA) 용액(세포층을 37°C)에 약 2°C로 치료한다.</li>
	<li>?...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

프로토콜은 호스트 세포에 세균 부착을 예매하기 위한 자동화된 접근 법을 설명합니다. 설명된 접근 방식은 기존의 방법에 비해 몇 가지 매력적인 장점이 있습니다. 첫째, 이러한 접근법은 개별 숙주 세포에 부착된 미생물 병원균 세포의 수의 정확한 정량화를 가능하게 한다. 중요하게도, 이러한 정량화는 고성세균 수확, 직렬 희석, 고체 매체에 도금, CFUs10,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

세균성 접착은 박테리아가 다른 세포 또는 표면에 부착하는 과정입니다. 세균성 병원체에 의한 감염의 성공적인 확립은 세포를 숙주하는 유착, 조직의 식민지화, 그리고 어떤 경우에는 숙주 세포의 침입1,2,3을필요로 한다. 최근 COVID-19전염병4,5,6에서입증된 바와 같이 신흥 전염병은 주요 공중 보건 위협을 구성한다. 중요한 것은, 새로운 또는 신흥 병원체는 게놈 기지를 둔 접근을 사용하여 쉽게 분별되지 않을 수 있습니다, 병원체가 검출을 회피하기 위하여 설계되었거나 병원성으로 그것을 확인하는 게놈 서명을 포함하지 않는 경우에 특히. 따라서, 숙주 세포에 세균 준수 같이 병원성의 특징을 직접 평가하는 방법을 사용하여 잠재적인 병원체의 식별은 병원균 식별에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
숙주 세포에 세균성 준수는 수십 년 동안 세균 성 병인의 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어 왔다1,7. 현미경 이미징8,9 및 세균식민지 형성 부(CFU)10,11,12,13의 열거형은 감염 후 도금에 의해 소주세포의 미생물 준수 및/또는감염을 테스트하기 위한 두 가지 잘 발달된 실험실 방법이다. 세균 세포의 마이크로미터 스케일 크기를 고려하여, 부착 세균 세포의 열거는 일반적으로 전자 현미경 검사법, 확장 현미경 검사법 (ExM)15,16및 3 차원 이미징17을 포함한 고해상도 이미징 접근법뿐만 아니라 고급 고배율 현미경 기술의 사용을 요구합니다. . 대안적으로, 숙주 세포 내에서 결합되거나 내면화된 박테리아의 열거량은 고체 천차에 수확된 박테리아의 희석 계열을 도금하고 결과 CFU10,12,13을계산하여 수행될 수 있다. 이 방법은 힘들며 고처리량 분석에 필요한 표준화또는 자동화된 절차를 수립하는 데 어려움을 야기하는 많은 수동 단계를 포함한다18,19. 따라서 호스트 셀 첨부 파일을 평가하기 위한 새로운 방법의 개발은 필드의 현재 제한을 해결합니다.
이러한 방법 중 하나는 높은 처리량 이미지 처리 및 통계 분석과 결합된 자동화된 높은 처리량 현미경 을 사용하는 것으로 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 접근법을 입증하기 위해, 인간, 동물,식물14,20의기회성 그람 음성 세균 병원균인 슈도모나스 아루기노사를포함한 여러 세균병원균을 실험하여 숙주 방어 기능이 손상된 환자의 호흡기를 식민지화하는 경우가 많았다. 이 접근법은 이전 연구에서 설명된 현미경 이미징 과정을최적화14,20. 이미징 검출은 형광 표지호스트 세포와 박테리아에 의해 단순화되어 그(것)들의 근접성을 급속하게 추적하기 위하여, 극적으로 박테리아를 구별하기 위한 고해상도 심상을 얻기 위하여 현미경 워크로드를 감소시켰습니다. 또한, 숙주 세포 및 박테리아를 세는 이미지의 자동 통계 분석은 숙주 세포당 부착 세균 수의 비율을 추정하기 위해 세균 CFU 도금의 수동 실험을 대체하였다. 이 방법의 호환성을 확인하기 위해, 다중 세균성 균주 및 숙주 세포 모형은 또한 리스테리아 단세포 유전자, 황색포도상구균, 바실러스 뇌엽서, 및 Klebsiella 폐렴과 같은, 또한 인간 적인 혈관 내피 세포 (HUVECs) 및 그 결과를 지원합니다, 및 결과는 체계의 다양성과 효과성을 지원합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

신흥 세균 병원체의 식별은 인간의 건강과 보안에 매우 중요합니다. 숙주 세포에 세균적인 준수는 세균성 감염에 있는 필수적인 단계이고 잠재적인 위협의 특징을 구성합니다. 따라서, 숙주 세포에 박테리아의 준수를 검토하는 것은 세균 위협 평가의 구성 요소로 사용될 수있다. 숙주 세포에 세균 부착을 열거하는 표준 방법은 숙주 세포와 박테리아를 공동 배양하고, 부착 된 박테리아를 수확하고, 고체 매체에 수확 된 세포를 플레이트한 다음, 결과 식민지 형성 단위 (CFU)를 계산하는 것이다. 대안적으로, 숙주 세포에 대한 세균준수는 면역형광 현미경-현미경 기지를 둔 접근법을 사용하여 평가될 수 있다. 그러나 이러한 접근 방식을 구현하기 위한 기존의 전략은 시간이 많이 걸리고 비효율적입니다. 여기서, 최근에 개발된 자동화형 형광 현미경-현미경-이미징 방법이 설명된다. 높은 처리량 이미지 처리 및 통계 분석과 결합하면 호스트 셀을 부착하는 박테리아의 신속한 정량화를 가능하게 합니다. 2개의 세균성 종, 그람 음성 슈도모나스 아루기노사 및 그람 양성 리스테리아 단세포 유전자 및 상응하는 부정적인 대조군, 프로토콜을 입증하기 위하여 시험되었다. 결과는 이 접근방식이 부착된 박테리아를 신속하고 정확하게 예매하고 실험적인 워크로드와 적시성보다 현저히 감소시킨다는 것을 보여줍니다.

형광 영상 기반 세균 준수 분석서를 개발하기 위해, P. aeruginosa 균주 PAO1 및 그 음성 준수 대응 대장균은 A549 세포에 이러한 박테리아의 준수가14,20,22에보고되었기 때문에 프로토콜 효과를 테스트하는 데 사용되었다. 먼저, GFP-표기표 P. aeruginosa (PAO1) 및 GFP 라벨 E. 대장균은 각각 다양한 MOI에서 인간 불?...

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Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.

호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

이 방법은 숙주 세포에 박테리아 준수의 신속하고 높은 처리량 검출을 제공합니다. 종래의 도금 방법에 비해, 부착된 박테리아의 정량화에 필요한 실습 시간을 줄입니다. 이 기술은 자동화되고, 시간 절약적이며, 매우 재현할 수 있습니다.그것은 또한 널리 호스트 셀의 대부분에 둘 다에 적용. 이 방법은 매우 간단합니다. 첫 번째 예심을 위해, 감염의 복합성 같이 조건, 또한 호스트 박테리아 공동 잠복기 시간을 최적화해야 합니다.먼저 실온에서 2 분 동안 13, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 기하급수적 인 단계에서 세균 배양을 수확하십시오. 1 밀리 리터 PBS로 세포 팔레트를 세척 한 후, 1 밀리 리터 PBS에서 세균 팔레트를 다시 중단. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 세균 현탁액의 농도를 결정합니다.그런 다음 세균 현탁액을 염색하기 위해 500 배 농축 육수 녹색 또는 빨간색 염색염2개를 세균 현탁액 1 밀리리터에 추가하여 염료를 한 배 희석시 넣습니다. 어둠 속에서 부드러운 회전으로 실온에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 30 분 후, 2 분 동안 13, 000 배 G에서 스테인드 박테리아를 원심 분리하고 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.2 분 동안 13, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 얼룩진 세균 세포를 수집합니다. 신선한 F12 K 배지의 1 밀리리터로 펠릿을 재연하고 600 나노미터에서 각 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 후속 감염 및 숙주 세포 농도의 복합성에 따라 원하는 농도로 배양을 희석시.세균 준수 분석의 경우, 이전에 배양 된 A549 세포 모노 층을 각 우물에 100 마이크로 리터를 추가하고 부드럽게 피펫을 위아래로 씻어 세 번 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 폐기합니다. 또는 PBS를 추가한 후 10초 동안 기다린 다음 진공을 사용하여 PBS를 제거합니다.세균성 협회의 운동성을 결정하기 위하여는, 감염의 다른 복합성으로 세균현약의 원하는 농도의 100 마이크로리터로 세포를 오버레이. 박테리아를 스핀 다운 하 고 추가 1 시간 동안 섭씨 37도및 5%이산화탄소에서 감염된 A549 세포를 배양. 입증 된 바와 같이 따뜻한 PBS로 모노 층을 5 번 세척하여 언바운드 박테리아를 제거합니다.다음으로, 얼음에 96 웰 플레이트의 모든 우물에 4 %의 포름알데히드의 100 마이크로 리터를 추가하여 세포를 수정합니다. 15분 후 PBS로 플레이트를 세 번 세척하여 고정 용액을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 밀리리터 DAPI 얼룩 당 50 나노 그램으로 핵에 얼룩.PBS로 세포를 세척한 후, 감염된 A549 세포를 PBS 100 마이크로리터로 덮어 건조를 피하고 어두운 에서 최대 2일 동안 4도에 접시를 보관하거나 이미징을 진행하십시오. 데이터 무결성을 유지하기 위해 각 웰의 5개 위치를 임의로 수동으로 선택하여 이미지를 20배 배율로 캡처합니다. GFP 채널, DAPI 의 밑에 박테리아의 형광 심상을 포착하고, 적색 형광염에 의해 염색된 박테리아에 대해 PE Si 5 채널을 사용합니다.더 나은 해상도를 달성하기 위한 목표에 따라 스무딩 을 위한 롤링 볼의 매개 변수를 설정하고 이미지 디온볼루션의 포인트 스프레드 함수를 자동으로 측정합니다. 숙주 세포 및 박테리아의 형광 강도를 측정합니다. 숙주 세포 및 박테리아의 가장 약한 형광 강도를 세포 수에 대한 임계값으로 설정하고 준수 박테리아로서 15 마이크로미터 거리 내에 있는 숙주 세포에 근접한 모든 박테리아를 계산한다.세포가 모든 자동화된 심상에서 계산되면 숙주 세포 수, 세포 크기 및 모양, 총 세균 수 및 숙주 세포당 평균 세균 계정과 같은 중요한 판독값을 분석하여 세균 성 준수를 결정하는 가장 중요한 지표입니다. 공동 인큐베이션의 1 시간 후, pseudomonas aeruginosa 균주 PAO1 용량 의존 방식으로 A549 세포에 부착. 유사한 결과는 또한 그람 양성 박테리아 리스테리아 단세포 유전자 및 그것의 부정적인 통제 간균 subtilis 때 관찰되었습니다.숙주 부착 P aeruginosa 세분화의 대표적인 이미지는이 프로토콜을 사용하여 세균 세포를 계산의 용이성을 보여줍니다. 자동화된 분석의 결과는 세균성 및 숙주 세포 수, 숙주 세포 당 평균 세균 성 수 및 숙주 세포 건강의 상태를 나타내는 영역, 세균성 준수 수준 및 세균 성 세포 독성을 포함한다. A549 세포 외에도 HUVECs는 준수 분석에 대해서도 테스트되었습니다.세라티아 루비다아와 연쇄상구균 아갈락시아는 HUVEC를 준수했지만 A549 세포는 아니며, 이 방법을 사용하여 숙주 세균 상호 작용을 연구하기 위해 여러 호스트의 효과적인 검출 및 적합성을 입증하였다. 숙주 세포는 우물의 바닥에 바람직하지 않은 박테리아 준수를 최소화하기 위해 약 90 ~ 100 %의 합류에 도달해야합니다. 이 기술은 연구원이 새로운 기계장치, 호스트 해충 상호 작용을 탐구하는 것을 허용할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

세균성 지속성에 미치는 영향을 밝히기 위해 화학 화합물의 높은 처리량 선별

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...