Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Vi er takknemlige til Dr. Kaite Zlotkowski fra Biotek Inc. for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet under kontraktsnummer W911NF1920013 til PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) og Department of Interior under Contract No. 140D6319C0029 til PdF. Innholdet i informasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis regjeringens posisjon eller politikk, og ingen offisiell tilslutning bør utledes.

1. A549 cellekultur
<ol><li>Vedlikehold A549-cellelinjen i F-12K medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Endre mediet hver 3-4 dager og passasje ved 85% -95% samløp.</li>
	<li>Skyll kort cellene med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4, med mindre annet er angitt) og behandle med 1 ml 0,25% Trypsin-0,53 mM etylendiamintetraacetisk syre (EDTA) oppløsning (nedsenket cellelaget) i ca. 2 min ved 37 °C.</li>
	<li>Tilsett ytterligere 6 ml komplett vekstmediu...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Protokollen beskriver en automatisert tilnærming for opplisting av bakteriell vedlegg til vertsceller. Den beskrevne tilnærmingen har flere attraktive fordeler i forhold til konvensjonelle metoder. For det første muliggjør denne tilnærmingen nøyaktig kvantifisering av antall mikrobielle patogenceller som er festet til individuelle vertsceller. Viktigst, denne kvantifiseringen kan utføres uten behov for arbeidskrevende bakteriell høsting, serielle fortynninger, plating på faste medier og bestemmelse av CFUer<sup ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Bakteriell vedheft er en prosess der bakterier festes til andre celler eller overflater. Vellykket etablering av infeksjon ved bakterielle patogener krever vedheft for å være vert for celler, kolonisering av vev, og i noen tilfeller invasjon av vertsceller1,2,3. Nye smittsomme sykdommer utgjør store folkehelsetrusler, som det fremgår av den nylige COVID-19-pandemien4,5,6. Det er viktig at nye eller nye patogener ikke lett kan ses ved hjelp av genombaserte tilnærminger, spesielt i tilfeller der patogenet er konstruert for å unngå deteksjon eller ikke inneholder genomiske signaturer som identifiserer det som patogent. Derfor kan identifisering av potensielle patogener ved hjelp av metoder som direkte vurderer kjennetegn på patogenisitet, som bakteriell overholdelse av vertsceller, spille en kritisk rolle i patogenidentifikasjon.
Bakteriell overholdelse av vertsceller har blitt brukt til å evaluere mekanismer for bakteriell patogenese i flere tiår1,7. Mikroskopisk avbildning8,9 og opplisting av bakteriell kolonidannende enhet (CFU)10,11,12,13 ved etterinfeksjonsbelegg er to velutviklede laboratoriemetoder for testing av mikrobiell tilslutning og/eller infeksjon av vertsceller14. Tatt i betraktning mikrometerskalastørrelsen på bakterieceller, krever opplistingen av de tilhørende bakteriecellene generelt bruk av avanserte mikroskopiteknikker med høy forstørrelse, samt høyoppløselige bildebehandlingsmetoder, inkludert elektronmikroskopi, ekspansjonsmikroskopi (ExM)15,16og tredimensjonal avbildning17 . Alternativt kan opplistingen av bakterier bundet til eller internalisert i vertsceller utføres ved å plating fortynningsserien av høstede bakterier på fast agar og telle de resulterende CFUs10,12,13. Denne metoden er arbeidskrevende og inneholder mange manuelle trinn, som introduserer vanskeligheter med å etablere en standardisert eller automatisert prosedyre som kreves for høygjennomstrømningsanalyser18,19. Derfor vil utviklingen av nye metoder for evaluering av vertscellevedlegg adressere gjeldende begrensninger i feltet.
En slik metode er beskrevet her som bruker automatisert mikroskopi med høy gjennomstrømning, kombinert med høy gjennomstrømningsbildebehandling og statistisk analyse. For å demonstrere tilnærmingen ble eksperimenter med flere bakterielle patogener utført, inkludert Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen av mennesker, dyr og planter14,20, som ofte antas å kolonisere luftveiene til pasienter med nedsatt vertsforsvarsfunksjoner. Denne tilnærmingen optimaliserte den mikroskopiske bildebehandlingsprosessen beskrevet i tidligere studier14,20. Avbildningsdeteksjonen ble forenklet av fluorescensmerkede vertsceller og bakterier for raskt å spore nærheten til dem, noe som dramatisk reduserte mikroskopiarbeidsbelastningen for å få høyoppløselige bilder for å skille bakterier. I tillegg erstattet den automatiserte statistiske analysen av bilder i telling av vertsceller og bakterier hånd-på-eksperimentet av bakteriell CFU-plating for å estimere forholdet mellom tilhenger bakterietall per vertscelle. For å bekrefte kompatibiliteten til denne metoden har flere bakteriestammer og vertscelletyper også blitt testet, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus og Klebsiella pneumoniae, samt humane navlestrengs endothelialceller (HUVECs), og resultatene støtter mangfoldet og effektiviteten av metoden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

Identifisering av nye bakterielle patogener er avgjørende for menneskers helse og sikkerhet. Bakteriell overholdelse av vertsceller er et viktig skritt i bakterielle infeksjoner og utgjør et kjennetegn på potensiell trussel. Derfor kan det å undersøke overholdelse av bakterier til vertsceller brukes som en komponent i bakteriell trusselvurdering. En standardmetode for å liste opp bakteriell overholdelse av vertsceller er å co-inkubere bakterier med vertsceller, høste de tilhørende bakteriene, plate de høstede cellene på faste medier, og deretter telle de resulterende kolonidannende enhetene (CFU). Alternativt kan bakteriell overholdelse av vertsceller evalueres ved hjelp av immunfluorescensmikroskopibaserte tilnærminger. Konvensjonelle strategier for implementering av disse tilnærmingene er imidlertid tidkrevende og ineffektive. Her beskrives en nylig utviklet automatisert fluorescensmikroskopibasert avbildningsmetode. Når metoden kombineres med bildebehandling med høy gjennomstrømning og statistisk analyse, muliggjør den rask kvantifisering av bakterier som holder seg til vertsceller. To bakteriearter, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa og Gram-positive Listeria monocytogenes og tilsvarende negative kontroller, ble testet for å demonstrere protokollen. Resultatene viser at denne tilnærmingen raskt og nøyaktig nummererer tilhengerbakterier og reduserer eksperimentelle arbeidsbelastninger og tidslinjer betydelig.

For å utvikle fluorescensavbildningsbasert bakteriell tilslutningsanalyse ble P. aeruginosa-stammen PAO1 og dens negative overholdelsesmotpart E. coli brukt til å teste protokolleffektiviteten, da overholdelsen av disse bakteriene til A549-celler hadde blitt rapportert14,20,22. For det første ble GFP-merket P. aeruginosa (PAO1) og GFP-merket E. coli co-inkubert med en menneskelig udødelig ...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Påvisning av vertsbakterielle patogeninteraksjoner basert på fenotypisk tilslutning ved bruk av fluorescensmerking med høy gjennomstrømning sammen med automatiserte statistiske analysemetoder muliggjør rask evaluering av potensielle bakterielle interaksjoner med vertsceller.

Automatisert, høy gjennomstrømningsdeteksjon av bakteriell overholdelse av vertsceller

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Denne metoden gir en rask, høy gjennomstrømningsdeteksjon av bakterier som overholder vertsceller. Sammenlignet med de konvensjonelle platingmetodene, reduserer det praktisk tid som kreves for kvantifisering av de tilhengerbakteriene. Denne teknikken er automatisert, tidsbesparende og veldig reproduserbar.Det er også mye brukt både på de fleste vertscellene. Denne metoden er veldig grei. For den første studien må forholdene som mangfoldet av infeksjon, og også vertsbakterienes ko inkubasjonstid optimaliseres.Høst først bakteriekulturene i en eksponentiell fase ved sentrifugering ved 13 000 ganger G i to minutter ved romtemperatur. Etter å ha vasket cellepallen med en milliliter PBS, resuspend bakteriepaletten i en milliliter PBS. Bestem konsentrasjonene av bakteriell suspensjon ved å måle optisk tetthet ved 600 nanometer.Deretter, for farging av bakteriell suspensjon, legg til to mikroliter av 500 ganger konsentrert lagergrønn eller rød farging fargestoff i en milliliter bakteriell suspensjon for å fortynne fargestoffet en brett. Inkuber cellene ved romtemperatur i 30 minutter med mild rotasjon i mørket. Etter 30 minutter sentrifugerer du de fargede bakteriene ved 13 000 ganger G i to minutter og bruker pelletsen på nytt i en milliliter PBS.Samle de fargede bakteriecellene ved sentrifugering ved 13 000 ganger G i to minutter. Resuspend pellet i en milliliter frisk F12 K medium og måle den optiske tettheten av hver kultur på 600 nanometer. Etterfølgende fortynne kulturene til de ønskede konsentrasjonene basert på mangfoldet av infeksjon og vertscellekonsentrasjon.For bakteriell tilslutningsanalyse, vask de tidligere kultiverte A549-cellemonolagene tre ganger ved å legge til 100 mikroliter varm PBS til hver brønn og forsiktig pipette opp og ned. Kast deretter PBS. Alternativt, etter å ha lagt til PBS, vent i 10 sekunder og fjern deretter PBS ved hjelp av vakuum.For å bestemme kinetikken til bakteriell assosiasjon, overlegg cellene med 100 mikroliter av ønskede konsentrasjoner av bakteriell suspensjon med forskjellig mangfold av infeksjon. Spinn ned bakteriene og inkuber de infiserte A549-cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i ytterligere en time. Fjern de ubundne bakteriene ved å vaske monolagene fem ganger med varm PBS som vist.Deretter fikser du cellene ved å legge til 100 mikroliter 4% formaldehyd i alle brønnene på en 96 brønnplate på isen. Etter 15 minutter, vask platen tre ganger med PBS for å fjerne fikseringsløsningen. Flekk i kjernen med 50 nanogram per milliliter DAPI-flekk i 10 minutter ved romtemperatur.Etter å ha vasket cellene med PBS, dekk de infiserte A549-cellene med 100 mikroliter PBS for å unngå tørking og lagre deretter platen på fire grader Celsius i opptil to dager i mørket eller fortsett med avbildning. Hvis du vil beholde dataintegriteten, velger du tilfeldig og manuelt fem steder for hver brønn for å ta bildene med 20 ganger forstørrelse. Ta fluorescerende bilder av bakterier under GFP-kanaler, A549-celler under DAPI, og for bakteriene som er farget av det røde fluorescerende fargestoffet, bruk PE Si fem kanaler.Angi parametrene for rullekulen for utjevning og automatisk mål punktspredningsfunksjonen til bildedekonvolusjon basert på målet om å oppnå bedre oppløsning. Mål fluorescensintensiteten til vertscellene og bakteriene. Sett den svakeste fluorescensintensiteten til vertsceller og bakterier som terskler for celletelling og tell alle bakteriene som proksimaler til en vertscelle innen 15 mikrometer avstand som tilslutningsbakterier.Når cellene er talt opp fra alle de automatiserte bildene, analyserer du kritiske avlesninger, for eksempel antall vertsceller, cellestørrelser og former, totalt bakterietall og den gjennomsnittlige bakteriekontoen per vertscelle, som er den viktigste indikatoren for å bestemme bakteriell tilslutning. Etter en time med co-inkubasjon fulgte pseudomonas aeruginosa stamme PAO1 A549-celler på en doseavhengig måte. Lignende resultater ble også observert når gram-positive bakterier listeria monocytogenes og dens negative kontroll bacillus subtilis.Et representativt bilde av vertens tilhenger P aeruginosa segmentering demonstrerer hvor enkelt det er å telle bakterieceller ved hjelp av denne protokollen. Resultatene av de automatiserte analysene inkluderer bakterielle og vertscelletellinger, gjennomsnittlig bakterietall per vertscelle og vertscellestørrelser og områder som representerer statusen til vertscellehelse, bakteriell tilslutningsnivå og bakteriell cytotoksisitet. Bortsett fra A549-celler ble HUVEC også testet for tilslutningsanalyse.Serratia rubidaea og streptokokker agalactiae var tilhenger av HUVEC, men ikke til A549 celler, og som demonstrerer effektiv deteksjon og egnethet av flere verter for å studere vertsbakterieinteraksjoner ved hjelp av denne metoden. Vertsceller bør nå rundt 90 til 100% sammenløp for å minimere uønskede bakterier overholdelse av bunnen av brønnene. Denne teknikken vil tillate forskere å utforske de nye mekanismene, vertsskadeinteraksjonene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi-baserte analyser for High-throughput screening av Host faktorer involvert i<em&gt; Brucella</em&gt; Infeksjon av HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering av en gjennomtrengelig membran Insert-baserte infeksjon System for å studere effekter av utskilt toksiner på Pattedyrvertsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Bruke en bakteriell patogen Probe for mobilnettet og Organismic-nivå vert svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for å belyse deres effekter på bakteriell utholdenhet

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...