Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
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Somos gratos ao Dr. Kaite Zlotkowski da Biotek Inc. por seu suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa sob o número do contrato W911NF1920013 para a PdF, a Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA) e o Departamento do Interior sob o contrato nº 140D6319C0029 ao PdF. O conteúdo das informações não reflete necessariamente a posição ou a política do Governo, e nenhum endosso oficial deve ser inferido.

1. Cultura celular A549
<ol><li>Mantenha a linha celular A549 em meio F-12K suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e incubar a 37 °C, 5% DE CO2.</li>
	<li>Mude o meio a cada 3-4 dias e passagem em 85%-95% de confluência.</li>
	<li>Brevemente, enxágue as células com 1 x soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS, pH 7.4, a menos que indicado de outra forma) e trate com 1 ml de 0,25% trypsin-0,53 mM solução de ácido ethylenodiaminatotracético (EDTA) (submergir a camada celular) por cerca de 2...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

O protocolo descreve uma abordagem automatizada para enumerar o apego bacteriano às células hospedeiras. A abordagem descrita tem várias vantagens atraentes em relação aos métodos convencionais. Em primeiro lugar, essa abordagem permite a quantificação precisa do número de células de patógenos microbianas que estão ligadas a células hospedeiras individuais. É importante ressaltar que essa quantificação pode ser realizada sem a necessidade de colheita bacteriana laboriosa, diluições seriais, revestimento...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

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Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

A adesão bacteriana é um processo pelo qual as bactérias se ligam a outras células ou superfícies. O estabelecimento bem-sucedido de infecção por patógenos bacterianos requer adesão às células hospedeiras, colonização de tecidos e, em alguns casos, invasão de células hospedeiras1,2,3. As doenças infecciosas emergentes constituem grandes ameaças à saúde pública, como evidenciado pela recente pandemia COVID-194,5,6. É importante ressaltar que patógenos novos ou emergentes podem não ser facilmente discernidos usando abordagens genômicas, especialmente nos casos em que o patógeno foi projetado para escapar da detecção ou não contém assinaturas genômicas que o identificam como patogênico. Portanto, a identificação de potenciais patógenos utilizando métodos que avaliam diretamente marcas de patogenicidade, como a adesão bacteriana às células hospedeiras, pode desempenhar um papel crítico na identificação de patógenos.
A adesão bacteriana às células hospedeiras tem sido usada para avaliar mecanismos de patogênese bacteriana há décadas1,7. A imagem microscópica8,9 e a enumeração da unidade formadora de colônias bacterianas (UFC)10,11,12,13 por revestimento pós-infecção são dois métodos laboratoriais bem desenvolvidos para testar a adesão microbiana e/ou infecção das células hospedeiras14. Considerando o tamanho da escala de micrômetros das células bacterianas, a enumeração das células bacterianas aderentes geralmente requer o uso de técnicas avançadas de microscopia de alta ampliação, bem como abordagens de imagem de alta resolução, incluindo microscopia eletrônica, microscopia de expansão (ExM)15,16e imagem tridimensional17 . Alternativamente, a enumeração de bactérias vinculadas ou internalizadas dentro das células hospedeiras pode ser realizada emplacando a série de diluição de bactérias colhidas em ágar sólido e contando as CFUs resultantes10,12,13. Este método é trabalhoso e inclui muitas etapas manuais, o que introduz dificuldades no estabelecimento de um procedimento padronizado ou automatizado necessário para análises de alto rendimento18,19. Portanto, o desenvolvimento de novos métodos para avaliar o anexo de células hospedeiras abordaria as limitações atuais no campo.
Um desses métodos é descrito aqui que utiliza microscopia automatizada de alto rendimento, combinada com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística. Para demonstrar a abordagem, foram realizados experimentos com diversos patógenos bacterianos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista de humanos, animais e plantas14,20, que é frequentemente encontrado para colonizar o trato respiratório de pacientes com funções de defesa hospedeiras prejudicadas. Essa abordagem otimou o processo de imagem microscópica descrito em estudos anteriores14,20. A detecção de imagens foi simplificada por células hospedeiras e bactérias rotuladas por fluorescência para rastrear rapidamente a proximidade delas, o que reduziu drasticamente a carga de trabalho de microscopia para obter imagens de alta resolução para distinguir bactérias. Além disso, a análise estatística automatizada de imagens na contagem de células hospedeiras e bactérias substituiu o experimento manual de revestimento de CFU bacteriano para estimar a razão da contagem bacteriana aderente por célula hospedeira. Para confirmar a compatibilidade deste método, também foram testadas múltiplas cepas bacterianas e tipos de células hospedeiras, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, bem como células endotelias de veia umbilicais humanas (HUVECs), e os resultados apoiam a diversidade e eficácia do método.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

A identificação de patógenos bacterianos emergentes é fundamental para a saúde e segurança humana. A adesão bacteriana às células hospedeiras é um passo essencial em infecções bacterianas e constitui uma marca de ameaça potencial. Portanto, examinar a adesão de bactérias às células hospedeiras pode ser usado como um componente da avaliação de ameaças bacterianas. Um método padrão para enumerar a adesão bacteriana às células hospedeiras é co-incubar bactérias com células hospedeiras, colher as bactérias aderentes, emplacar as células colhidas em meios sólidos e, em seguida, contar as unidades de formação de colônias resultantes (UFC). Alternativamente, a adesão bacteriana às células hospedeiras pode ser avaliada usando abordagens baseadas em microscopia de imunofluorescência. No entanto, as estratégias convencionais para a implementação dessas abordagens são demoradas e ineficientes. Aqui, um método de imagem baseado em microscopia de fluorescência automatizada recentemente desenvolvido é descrito. Quando combinado com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística, o método permite quantificação rápida de bactérias que aderem às células hospedeiras. Duas espécies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa gram-negativa e monocytogenes listeria gram-positiva e controles negativos correspondentes, foram testadas para demonstrar o protocolo. Os resultados mostram que essa abordagem enumera de forma rápida e precisa as bactérias aderentes e reduz significativamente as cargas de trabalho experimentais e cronogramas.

Para desenvolver o ensaio de adesão bacteriana baseada em imagem de fluorescência, p. aeruginosa cepa PAO1 e sua contraparte de adesão negativa E. coli foram usados para testar a eficácia do protocolo, uma vez que a adesão dessas bactérias às células A549 havia sido relatada14,20,22. Primeiro, a GFP, rotulada P. aeruginosa (PAO1) e E. coli, rotulada por GFP, foram co-incubadas com uma ...

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Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Este método fornece uma rápida e alta detecção de adesão de bactérias às células hospedeiras. Em comparação com os métodos convencionais de revestimento, reduz o tempo prático necessário para a quantificação das bactérias aderentes. Esta técnica é automatizada, que economiza tempo e muito reproduzível.Também é amplamente aplicado tanto na maioria das células hospedeiras. Este método, é muito simples. Para o primeiro ensaio, as condições como a multiplicidade de infecção, e também o tempo de co-incubação de bactérias hospedeiras devem ser otimizadas.Primeiro colher as culturas bacterianas em uma fase exponencial por centrifugação a 13.000 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar a paleta de células com um MILilitro PBS, resuspense a paleta bacteriana em um PBS mililitro. Determine as concentrações de suspensão bacteriana medindo a densidade óptica em 600 nanômetros.Em seguida, para colorir a suspensão bacteriana, adicione dois microliters do estoque concentrado de 500 vezes de corante verde ou vermelho em um mililitro de suspensão bacteriana para diluir o corante uma dobra. Incubar as células à temperatura ambiente por 30 minutos com rotação suave no escuro. Após 30 minutos, centrifugar a bactéria manchada a 13.000 vezes G por dois minutos e resuspensar a pelota em um mililitro de PBS.Colete as células bacterianas manchadas por centrifugação a 13.000 vezes G por dois minutos. Resuspende a pelota em um mililitro de médio F12 K fresco e meça a densidade óptica de cada cultura em 600 nanômetros. Posteriormente diluir as culturas às concentrações desejadas com base na multiplicidade de infecção e concentração celular hospedeira.Para o ensaio de adesão bacteriana, lave as camadas mono de células A549 previamente cultivadas três vezes adicionando 100 microliters de PBS quente a cada poço e delicadamente pipeta para cima e para baixo. Em seguida, descarte PBS. Alternativamente, depois de adicionar PBS, aguarde 10 segundos e, em seguida, remova o PBS usando vácuo.Para determinar a cinética da associação bacteriana, sobreponha as células com 100 microliters de concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes multiplicidade de infecção. Desça as bactérias e incuba as células A549 infectadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por mais uma hora. Remova as bactérias ilimitadas lavando as camadas mono cinco vezes com PBS quente, como demonstrado.Em seguida, conserte as células adicionando 100 microlitrais de 4% de formaldeído em todos os poços de uma placa de 96 poços no gelo. Após 15 minutos, lave a placa três vezes com PBS para remover a solução de fixação. Mancha nos núcleos com 50 nanogramas por mancha de DAPI mililitro por 10 minutos à temperatura ambiente.Depois de lavar as células com PBS, cubra as células A549 infectadas com 100 microliters de PBS para evitar a secagem e, em seguida, armazene a placa a quatro graus Celsius por até dois dias no escuro ou prossiga para a imagem. Para manter a integridade dos dados, escolha aleatoriamente e manualmente cinco locais de cada poço para capturar as imagens em 20 vezes a ampliação. Capture as imagens fluorescentes de bactérias sob canais GFP, células A549 sob DAPI, e para as bactérias manchadas pelo corante fluorescente vermelho use pe si cinco canal.Defina os parâmetros da bola rolante para suavizar e medir automaticamente a função de propagação de pontos da desconvolução da imagem com base no objetivo de alcançar uma melhor resolução. Meça a intensidade da fluorescência das células hospedeiras e bactérias. Defina a intensidade de fluorescência mais fraca das células hospedeiras e bactérias como os limiares para a contagem de células e conte todas as bactérias próximas a uma célula hospedeira dentro de 15 micrômetros de distância como as bactérias de adesão.Uma vez que as células tenham sido contadas a partir de todas as imagens automatizadas, analise leituras críticas, como contagem de células hospedeiras, tamanhos e formas de células, contagem total de bactérias e a conta bacteriana média por célula hospedeira, que é o indicador mais importante para determinar a adesão bacteriana. Após uma hora de co incubação, pseudomonas aeruginosa cepa PAO1 aderiu às células A549 de forma dependente. Resultados semelhantes também foram observados quando as bactérias gram-positivas listeria monocytogenes e seu controle negativo bacilo subtilis.Uma imagem representativa da segmentação P aeruginosa aderente demonstra a facilidade de contar células bacterianas usando este protocolo. Os resultados das análises automatizadas incluem contagens de células bacterianas e hospedeiras, contagem média de bactérias por célula hospedeira e tamanhos de células hospedeiras e áreas que representam o status da saúde das células hospedeiras, nível de adesão bacteriana e toxicidade de cito bacteriano. Além das células A549, os HUVECs também foram testados para ensaio de adesão.Serratia rubidaea e estreptococo agalactiae foram aderentes ao HUVEC, mas não às células A549, e o que demonstra a efetiva detecção e adequação de vários hospedeiros para estudar as interações de bactérias hospedeiras usando este método. As células hospedeiras devem atingir cerca de 90 a 100% de confluência para minimizar a indesejável adesão de bactérias ao fundo dos poços. Essa técnica permitirá aos pesquisadores explorar os novos mecanismos, as interações hospedeira-peste.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...