Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Мы благодарны доктору Кайте Злотковски из Biotek Inc. за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством обороны по контракту W911NF1920013 с PdF, Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA) и Министерством внутренних дел по контракту No 140D6319C0029 с PdF. Содержание информации не обязательно отражает позицию или политику правительства, и не следует делать никаких выводов об официальном одобрении.

1. Культура клеток A549
<ol><li>Поддерживать клеточную линию A549 в среде F-12K, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и инкубировать при 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Менять среду каждые 3-4 дня и проходить при 85%-95% слиянии.</li>
	<li>Вкратце промыть клетки 1 х фосфатно-буферным физиологическим раствор?...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Протокол описывает автоматизированный подход к перечислению бактериальной привязанности к клеткам-хозяевам. Описанный подход имеет ряд привлекательных преимуществ перед обычными методами. Во-первых, этот подход позволяет точно количественно оценить количество клеток микробного па...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Бактериальная адгезия - это процесс, посредством которого бактерии прикрепляются к другим клеткам или поверхностям. Успешное установление инфекции бактериальными возбудителями требует адгезии к клеткам-хозяевам, колонизации тканей, а в некоторых случаях и инвазии клеток-хозяев1,2,3. Возникающие инфекционные заболевания представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению, о чем свидетельствует недавняя пандемияCOVID-19 4,5,6. Важно отметить, что новые или возникающие патогены не могут быть легко распознаны с использованием геномных подходов, особенно в тех случаях, когда патоген был спроектирован так, чтобы избежать обнаружения или не содержит геномных сигнатур, которые идентифицируют его как патогенный. Поэтому идентификация потенциальных патогенов с использованием методов, которые непосредственно оценивают признаки патогенности, такие как бактериальная приверженность клеткам-хозяевам, может играть решающую роль в идентификации патогенов.
Бактериальная адгезия к клеткам-хозяевам использовалась для оценки механизмов бактериального патогенеза на протяжениидесятилетий 1,7. Микроскопическая визуализация8,9 и перечисление бактериальной колониеобразующей единицы (КОЕ)10,11,12,13 путем постинфекционного покрытия являются двумя хорошо разработанными лабораторными методами тестирования микробной адгезии и/или инфицирования клеток-хозяев14. Учитывая размер бактериальных клеток в микрометровом масштабе, перечисление адгезивных бактериальных клеток обычно требует использования передовых методов микроскопии с высоким увеличением, а также подходов к визуализации с высоким разрешением, включая электронную микроскопию, расширительную микроскопию (ExM)15,16и трехмерную визуализацию17 . Альтернативно, перечисление бактерий, связанных или интернализованных внутри клеток-хозяев, может быть выполнено путем покрытия серии разбавления собранных бактерий на твердом агаре и подсчета результирующих КОЕ10,12,13. Этот метод трудоемкий и включает в себя множество ручных шагов, что создает трудности в создании стандартизированной или автоматизированной процедуры, необходимой для высокопроизводительных анализов18,19. Таким образом, разработка новых методов оценки прикрепления клеток-хозяев позволит устранить текущие ограничения в этой области.
Здесь описан один из таких методов, который использует автоматизированную высокопроизводительную микроскопию в сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом. Чтобы продемонстрировать подход, были проведены эксперименты с несколькими бактериальными патогенами, в том числе Pseudomonas aeruginosa,оппортунистическим грамотрицательным бактериальным патогеном человека, животных и растений14,20,который часто обнаруживается для колонизации дыхательных путей пациентов с нарушенными защитными функциями хозяина. Этот подход оптимизировал процесс микроскопической визуализации, описанный в предыдущих исследованиях14,20. Обнаружение изображений было упрощено флуоресцентно-мечеными клетками-хозяевами и бактериями для быстрого отслеживания их близости, что значительно снизило рабочую нагрузку микроскопии для получения изображений с высоким разрешением для различения бактерий. Кроме того, автоматизированный статистический анализ изображений при подсчете клеток-хозяев и бактерий заменил ручной эксперимент по бактериальному покрытию КОЕ для оценки соотношения количества адгезивных бактерий на клетку-хозяина. Чтобы подтвердить совместимость этого метода, также были протестированы множественные бактериальные штаммы и типы клеток-хозяев, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Klebsiella pneumoniae, а также эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVECs), и результаты подтверждают разнообразие и эффективность метода.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

Идентификация новых бактериальных патогенов имеет решающее значение для здоровья и безопасности человека. Бактериальная приверженность клеткам-хозяевам является важным шагом при бактериальных инфекциях и представляет собой признак потенциальной угрозы. Поэтому изучение приверженности бактерий к клеткам-хозяевам может быть использовано в качестве компонента оценки бактериальной угрозы. Стандартный метод перечисления бактериальной приверженности клеткам-хозяевам заключается в совместной инкубации бактерий с клетками-хозяевами, сборе адгезивных бактерий, нанесении собранных клеток на твердые среды, а затем подсчете результирующих колониеобразующих единиц (КОЕ). Альтернативно, бактериальная приверженность к клеткам-хозяевам может быть оценена с использованием подходов, основанных на иммунофлуоресцентной микроскопии. Однако традиционные стратегии реализации этих подходов отнимают много времени и неэффективны. Здесь описан недавно разработанный автоматизированный метод визуализации на основе флуоресцентной микроскопии. В сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом метод позволяет быстро количественно оценить бактерии, которые прилипают к клеткам-хозяевам. Два вида бактерий, Gram-отрицательный Pseudomonas aeruginosa и Gram-positive Listeria monocytogenes и соответствующие отрицательные контрольные группы, были протестированы для демонстрации протокола. Результаты показывают, что этот подход быстро и точно перечисляет адгезивные бактерии и значительно снижает экспериментальные нагрузки и сроки.

Для разработки анализа бактериальной приверженности на основе флуоресцентной визуализации штамм P. aeruginosa PAO1 и его аналог с отрицательной адгезией E. coli были использованы для проверки эффективности протокола, поскольку сообщалось о прилипании этих бактерий к клеткам A549<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Обнаружение взаимодействий патогенов-хозяев и бактерий на основе фенотипической приверженности с использованием высокопроизводительной флуоресцентной маркировки изображений наряду с автоматизированными методами статистического анализа позволяет быстро оценить потенциальные бактериальные взаимодействия с клетками-хозяевами.

Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Этот метод обеспечивает быстрое, высокопроизводительное обнаружение прилипания бактерий к клеткам-хозяевам. По сравнению с обычными методами покрытия, это сокращает практическое время, необходимое для количественной оценки адгезивных бактерий. Этот метод автоматизирован, экономит время и очень воспроизводим.Он также широко применяется как к большинству клеток-хозяев. Этот метод, есть очень простой. Для первого испытания необходимо оптимизировать такие условия, как множественность инфекции, а также время совместной инкубации бактерий-хозяев.Сначала собирают бактериальные культуры в экспоненциальной фазе путем центрифугирования в 13 000 раз G в течение двух минут при комнатной температуре. После промывки поддона клеток одним миллилитром PBS повторно суспендируют бактериальную палитру в одном миллилитре PBS. Определение концентраций бактериальной суспензии путем измерения оптической плотности на 600 нанометров.Затем, для окрашивания бактериальной суспензии, добавьте два микролитра 500-кратного концентрированного зеленого или красного окрашивающего красителя в один миллилитр бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в одну складку. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 30 минут с легким вращением в темноте. Через 30 минут центрифугируют окрашенные бактерии в 13 000 раз G в течение двух минут и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре PBS.Соберите окрашенные бактериальные клетки путем центрифугирования при 13 000 G в течение двух минут. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре свежей среды F12 K и измеряют оптическую плотность каждой культуры на уровне 600 нанометров. Впоследствии разбавляют культуры до нужных концентраций на основе множественности инфекции и концентрации клеток-хозяев.Для анализа бактериальной приверженности промыть ранее культивируемые монослои клеток A549 три раза, добавив 100 микролитров теплого PBS в каждую лунку и осторожно пипетку вверх и вниз. Затем отбросьте PBS. Кроме того, после добавления PBS подождите 10 секунд, а затем удалите PBS с помощью вакуума.Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, накладывают на клетки 100 микролитров желаемых концентраций бактериальной суспензии с разной кратностью инфекции. Раскрутите бактерии и инкубируйте инфицированные клетки A549 при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение дополнительного одного часа. Удалите несвязанные бактерии, промыв монослои пять раз теплым PBS, как показано на рисунке.Затем зафиксируйте ячейки, добавив 100 микролитров 4% формальдегида во все колодцы 96-луночной пластины на льду. Через 15 минут трижды промойте пластину PBS, чтобы удалить раствор для фиксации. Окрашивание в ядра с 50 нанограммами на миллилитр пятна DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре.После промывки клеток PBS накройте инфицированные клетки A549 100 микролитрами PBS, чтобы избежать высыхания, а затем храните пластину при четырех градусах Цельсия в течение двух дней в темноте или приступайте к визуализации. Чтобы сохранить целостность данных, случайным образом и вручную выберите пять мест каждой скважины, чтобы захватить изображения с 20-кратным увеличением. Захват флуоресцентных изображений бактерий под каналами GFP, клеток A549 под DAPI, а для бактерий, окрашенных красным флуоресцентным красителем, используйте пятиканальный PE Si.Установите параметры катящегося шара для сглаживания и автоматически измерьте функцию точечного распространения деконволюции изображения на основе цели достижения лучшего разрешения. Измерьте интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий. Установите самую слабую интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий в качестве пороговых значений для подсчета клеток и подсчитайте все бактерии, находящиеся рядом с клеткой-хозяином на расстоянии 15 микрометров, как бактерии адгезии.После того, как клетки были подсчитаны из всех автоматизированных изображений, проанализируйте критические показания, такие как количество клеток-хозяев, размеры и формы клеток, общее количество бактерий и средний учет бактерий на клетку-хозяина, что является наиболее важным показателем для определения бактериальной приверженности. После одного часа совместной инкубации штамм pseudomonas aeruginosa PAO1 прилипал к клеткам A549 в зависимости от дозы. Аналогичные результаты наблюдались и при грамположительных бактериях listeria monocytogenes и ее отрицательном контроле bacillus subtilis.Репрезентативное изображение сегментации P aeruginosa хозяина демонстрирует легкость подсчета бактериальных клеток с использованием этого протокола. Результаты автоматизированного анализа включают количество бактериальных клеток и клеток-хозяев, среднее количество бактерий на клетку-хозяина и размеры клеток-хозяев и области, представляющие состояние здоровья клеток-хозяев, уровень бактериальной приверженности и бактериальную цитоксичность. Помимо ячеек A549, HUVEC также были протестированы для анализа адгезии.Serratia rubidaea и streptococcus agalactiae были привержены HUVEC, но не клеткам A549, и что демонстрирует эффективное обнаружение и пригодность нескольких хозяев для изучения взаимодействия бактерий-хозяев с использованием этого метода. Клетки-хозяева должны достигать от 90 до 100% слияния, чтобы свести к минимуму прилипание нежелательных бактерий к дну скважин. Этот метод позволит исследователям исследовать новые механизмы, взаимодействия хозяина и вредителя.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в<em&gt; Brucella</em&gt; Инфицирование клеток HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Высокопроизводительный скрининг химических соединений для выяснения их влияния на бактериальную персистенцию

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...