Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Dr. Kaite Zlotkowski på Biotek Inc. för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet under kontraktsnummer W911NF1920013 till PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) och inrikesdepartementet under kontrakt nr 140D6319C0029 till PdF. Innehållet i informationen återspeglar inte nödvändigtvis regeringens ståndpunkt eller politik, och inget officiellt godkännande bör härledas.

1. A549 cellkultur
<ol><li>Behåll A549-cellinjen i F-12K medium kompletterat med 10% fetalt bovin serum (FBS) och inkubera vid 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Byt medium var 3-4 dagar och passage vid 85%-95% confluency.</li>
	<li>Skölj kort cellerna med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4, om inget annat anges) och behandla med 1 ml trypsin-0,53 mM etylendiamintetraacetic acid (EDTA) lösning (nedsänkning av cellskiktet) i ca 2 min vid 37 °C.</li>
	<li>Lägg till ytterligare 6 ml komplett tillväxtmedi...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Protokollet beskriver en automatiserad metod för att räkna upp bakteriell bilaga till värdceller. Det beskrivna tillvägagångssättet har flera attraktiva fördelar jämfört med konventionella metoder. För det första möjliggör detta tillvägagångssätt exakt kvantifiering av antalet mikrobiella patogenceller som är kopplade till enskilda värdceller. Viktigt är att denna kvantifiering kan utföras utan behov av mödosam bakteriell skörd, seriella utspädningar, plätering på fasta medier och bestämning av ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Bakteriell vidhäftning är en process där bakterier fäster vid andra celler eller ytor. Framgångsrik etablering av infektion av bakteriella patogener kräver vidhäftning för att vara värdceller, kolonisering av vävnader och i vissa fall invasion av värdceller1,2,3. Nya infektionssjukdomar utgör stora hot mot folkhälsan, vilket framgår av den senaste covid-19-pandemin4,5,6. Viktigt är att nya eller framväxande patogener inte lätt kan urskiljas med hjälp av genomiska metoder, särskilt i fall där patogenen har konstruerats för att undvika upptäckt eller inte innehåller genomiska signaturer som identifierar den som patogen. Därför kan identifiering av potentiella patogener med metoder som direkt bedömer kännetecken för patogenicitet, som bakteriell vidhäftning till värdceller, spela en avgörande roll i patogenidentifiering.
Bakteriell vidhäftning till värdceller har använts för att utvärdera mekanismer för bakteriell patogenes i årtionden1,7. Mikroskopisk avbildning8,9 och uppräkning av bakteriell kolonibildande enhet (CFU)10,11,12,13 genom plätering efter infektion är två välutvecklade laboratoriemetoder för testning av mikrobiell vidhäftning och/eller infektion i värdceller14. Med tanke på bakteriecellernas mikrometerskala kräver uppräkningen av de vidhäftande bakteriecellerna i allmänhet användning av avancerade mikroskopitekniker med hög förstoring, liksom högupplösta avbildningsmetoder, inklusive elektronmikroskopi, expansionsmikroskopi (ExM)15,16och tredimensionell avbildning17 . Alternativt kan uppräkning av bakterier som är bundna till eller internaliserade i värdceller utföras genom att plätera utspädningsserien av skördade bakterier på fast agar och räkna de resulterande CFUs10,12,13. Denna metod är mödosam och innehåller många manuella steg, vilket introducerar svårigheter att upprätta en standardiserad eller automatiserad procedur som krävs för analyser med hög genomströmning18,19. Därför skulle utvecklingen av nya metoder för utvärdering av värdcellbilaga ta itu med aktuella begränsningar i fältet.
En sådan metod beskrivs här som använder automatiserad hög genomströmningsmikroskopi, kombinerat med bildbehandling med högt genomströmning och statistisk analys. För att demonstrera tillvägagångssättet utfördes experiment med flera bakteriella patogener, inklusive Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk gramnegativ bakteriell patogen hos människor, djur och växter14,20, som ofta finns för att kolonisera andningsorganen hos patienter med nedsatt värdförsvarsfunktioner. Detta tillvägagångssätt optimerade den mikroskopiska avbildningsprocessen som beskrivs i tidigare studier14,20. Bildframställningsdetekteringen förenklades av fluorescensmärkta värdceller och bakterier för att snabbt spåra närheten till dem, vilket dramatiskt minskade mikroskopibelastningen för att få högupplösta bilder för att särskilja bakterier. Dessutom ersatte den automatiserade statistiska analysen av bilder vid räkning av värdceller och bakterier det hand-on experimentet med bakteriell CFU-plätering för att uppskatta förhållandet mellan vidhäftande bakterieantal per värdcell. För att bekräfta kompatibiliteten hos denna metod har flera bakteriestammar och värdcelltyper också testats, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus och Klebsiella pneumoniae, liksom mänskliga navelvensendotelceller (HUVECs), och resultaten stöder metodens mångfald och effektivitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

Identifiering av framväxande bakteriella patogener är avgörande för människors hälsa och säkerhet. Bakteriell följsamhet till värdceller är ett viktigt steg i bakteriella infektioner och utgör ett kännetecken för potentiellt hot. Därför kan undersökning av vidhäftningen av bakterier till värdceller användas som en komponent i bakteriell hotbedömning. En standardmetod för att räkna upp bakteriell vidhäftning till värdceller är att samtidigt inkubera bakterier med värdceller, skörda de vidhäftande bakterierna, plätera de skördade cellerna på fasta medier och sedan räkna de resulterande kolonibildande enheterna (CFU). Alternativt kan bakteriell vidhäftning till värdceller utvärderas med hjälp av immunofluorescensmikroskopibaserade metoder. Konventionella strategier för att genomföra dessa metoder är dock tidskrävande och ineffektiva. Här beskrivs en nyligen utvecklad automatiserad fluorescensmikroskopibaserad avbildningsmetod. I kombination med bildbehandling med hög genomströmning och statistisk analys möjliggör metoden snabb kvantifiering av bakterier som håller sig till värdceller. Två bakteriearter, gramnegativa Pseudomonas aeruginosa och grampositiva Listeria monocytogenes och motsvarande negativa kontroller, testades för att påvisa protokollet. Resultaten visar att detta tillvägagångssätt snabbt och exakt räknar upp vidhäftande bakterier och avsevärt minskar experimentella arbetsbelastningar och tidslinjer.

För att utveckla den fluorescensavbildningsbaserade bakterieupplevnadsanalysen användes P. aeruginosa stam PAO1 och dess negativa vidhäftningsmotsvarighet E. coli för att testa protokollets effektivitet, eftersom vidhäftningen av dessa bakterier till A549-celler hade rapporterats14,20,22. För det första var GFP- märkt P. aeruginosa (PAO1) och GFP-märkta E. coli co-incubated med en hum...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Detektion av värd-bakteriell patogen interaktioner baserat på fenotypisk vidhäftning med hjälp av hög genomströmning fluorescens märkning märkning imaging tillsammans med automatiserade statistiska analys metoder möjliggör snabb utvärdering av potentiella bakteriella interaktioner med värdceller.

Automatiserad, hög genomströmningsdetektering av bakteriell efterlevnad av värdceller

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Denna metod ger en snabb, hög genomströmningsdetektering av bakteriers vidhäftning till värdceller. Jämfört med de konventionella pläteringsmetoderna minskar det den praktiska tiden som krävs för kvantifiering av de vidhäftande bakterierna. Denna teknik är automatiserad, tidsbesparande och mycket reproducerbar.Det tillämpas också i stor utsträckning både på de flesta värdcellerna. Denna metod, det finns mycket enkelt. För den första studien måste förhållandena som infektionens mångfald, och även värdbakteriernas saminkubationstid optimeras.Skörda först bakteriekulturerna i en exponentiell fas genom centrifugering vid 13 000 gånger G i två minuter vid rumstemperatur. Efter att ha tvättat cellernas pall med en milliliter PBS, återanvänd bakteriepaletten i en milliliter PBS. Bestäm koncentrationerna av bakteriell suspension genom att mäta optisk densitet vid 600 nanometer.Sedan, för färgning av bakteriesuspensionen, tillsätt två mikroliter av den 500 vik koncentrerade buljongen grön eller röd färgning färgning i en milliliter bakteriell suspension för att späda färgämnet ett veck. Inkubera cellerna vid rumstemperatur i 30 minuter med mild rotation i mörkret. Efter 30 minuter, centrifugera de färgade bakterierna vid 13 000 gånger G i två minuter och återanvänd pelleten i en milliliter PBS.Samla de färgade bakteriecellerna genom centrifugering vid 13 000 gånger G i två minuter. Återanvänd pelleten i en milliliter färskT F12 K-medium och mät den optiska densiteten för varje kultur till 600 nanometer. Späd påföljande kulturer till önskade koncentrationer baserat på multiplicity av infektion och värdcellkoncentration.För bakteriell vidhäftning, tvätta de tidigare odlade A549-cellmonoskikten tre gånger genom att tillsätta 100 mikroliter varm PBS till varje brunn och försiktigt pipetter upp och ner. Kassera sedan PBS. Alternativt, efter att ha lagt till PBS, vänta i 10 sekunder och ta sedan bort PBS med vakuum.För att bestämma kinetiken hos bakteriell association, överlagra cellerna med 100 mikroliter av önskade koncentrationer av bakteriell suspension med olika multiplicitet av infektion. Snurra ner bakterierna och inkubera de infekterade A549-cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i ytterligare en timme. Ta bort de obundna bakterierna genom att tvätta monolagren fem gånger med varm PBS som visats.Fixa sedan cellerna genom att tillsätta 100 mikroliter av 4% formaldehyd i alla brunnar på en 96 brunnsplatta på isen. Tvätta plattan tre gånger med PBS efter 15 minuter för att ta bort fixeringslösningen. Fläck i atomkärnorna med 50 nanogram per milliliter DAPI-fläck i 10 minuter vid rumstemperatur.Efter att ha tvättat cellerna med PBS, täck de infekterade A549-cellerna med 100 mikroliter PBS för att undvika torkning och förvara sedan plattan vid fyra grader Celsius i upp till två dagar i mörkret eller fortsätt för avbildning. För att upprätthålla dataintegriteten väljer du slumpmässigt och manuellt fem platser för varje brunn för att fånga bilderna vid 20 gånger förstoring. Fånga fluorescerande bilder av bakterier under GFP-kanaler, A549-celler under DAPI, och för bakterierna färgade av det röda fluorescerande färgämnet använd PE Si femkanal.Ställ in parametrarna för den rullande bollen för utjämning och mät automatiskt punktspridningsfunktionen för bilddekonvolution baserat på målet för att uppnå bättre upplösning. Mät fluorescensintensiteten hos värdcellerna och bakterierna. Ställ in den svagaste fluorescensintensiteten hos värdceller och bakterier när trösklarna för cellantal och räkna alla bakterier som proximat till en värdcell inom 15 mikrometeravstånd som vidhäftningsbakterier.När cellerna har räknats från alla automatiserade bilder analyserar du kritiska avläsningar, till exempel värden cell antal, cellstorlekar och former, totala bakterieantal och det genomsnittliga bakteriekontot per värdcell, vilket är den viktigaste indikatorn för att bestämma bakteriell vidhäftning. Efter en timmes co inkubation, pseudomonas aeruginosa stam PAO1 följt A549 celler i en dos beroende mode. Liknande resultat observerades också när grampositiva bakterier listeria monocytogenes och dess negativa kontroll bacillus subtilis.En representativ bild av värd anhängare P aeruginosa segmentering visar hur lätt det är att räkna bakterieceller med hjälp av detta protokoll. Resultaten av de automatiserade analyserna inkluderar antalet bakterie- och värdceller, det genomsnittliga antalet bakterier per värdcell och värdcellsstorlekar och områden som representerar statusen för värdcellshälsa, bakteriell vidhäftningsnivå och bakteriell cytotoxicitet. Förutom A549 celler, HUVECs testades också för adherence analys.Serratia rubidaea och streptococcus agalactiae var vidhäftande till HUVEC, men inte till A549 celler, och som visar effektiv detektion och lämplighet av flera värdar att studera värdbakterier interaktioner med denna metod. Värdceller bör nå cirka 90 till 100% sammanflöde för att minimera oönskade bakteriers vidhäftning till botten av brunnarna. Denna teknik kommer att göra det möjligt för forskare att utforska de nya mekanismerna, värd-skadedjur interaktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi baserade analyser för high-throughput screening av Host faktorer som<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion av HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Genomförande av ett permeabelt membran Insert-baserade Infection System för att studera effekterna av utsöndrade bakteriella toxiner på däggdjursvärdceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Med en bakterie patogen att sonden för cellulär och organismnivå-nivå värd Svaren

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Screening av kemiska föreningar med hög genomströmning för att belysa deras effekter på bakteriell persistens

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...