Name: automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Biotek A.Ş.'den Dr. Kaite Zlotkowski'ye teknik destekleri için minnettarız. Bu çalışma Savunma Bakanlığı tarafından W911NF1920013 sözleşme numarası altında PDF, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) ve İçişleri Bakanlığı tarafından PDF'ye 140D6319C0029 sözleşme numarası altında desteklenmiştir. Bilgilerin içeriği mutlaka Hükümetin konumunu veya politikasını yansıtmaz ve resmi bir onay çıkarılmamalıdır.

1. A549 hücre kültürü
<ol><li>%10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş F-12K ortamında A549 hücre hattını koruyun ve 37 °C, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin ve % 85-% 95 izdiahta geçiş.</li>
	<li>Kısaca, hücreleri 1 x fosfat tamponlu salin (AKSI belirtilmedikçe pS, pH 7.4) ile durulayın ve 1 ml%0.25 Trypsin-0.53 mM etileniaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi (hücre tabakasını batırarak) ile yaklaşık 2 dakika boyunca 37 °C'de t...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells.">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li><li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li><li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion:+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms.">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).</li><li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Crax&#236;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver.">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li><li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+molecular,+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+(COVID-19),+a+comprehensive+literature+review.">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).</li><li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19.">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li><li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression.">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection.">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes.">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192 (2021).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication.">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans.">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).</li><li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors.">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).</li><li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+host+IRE1&#945;-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis.">Activation of host IRE1&#945;-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).</li><li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells.">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li><li>G&#246;tz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173 (2020).</li><li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy.">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).</li><li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization.">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).</li><li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts.">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).</li><li>Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates.">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li><li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells.">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li><li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice.">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li><li>R&#233;glier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+LpeA,+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes.">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li><li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells.">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li></ol>

Protokol, konak hücrelere bakteriyel bağlanmayı numaralandırmak için otomatik bir yaklaşım açıklar. Açıklanan yaklaşımın geleneksel yöntemlere göre birkaç çekici avantajı vardır. İlk olarak, bu yaklaşım, tek tek konak hücrelere bağlı mikrobiyal patojen hücrelerinin sayısının kesin olarak ölçülmesini sağlar. Daha da önemlisi, bu niceleme zahmetli bakteriyel hasat, seri seyreltmeler, katı ortamlarda kaplama ve CFO10, 11,12</...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Bakteriyel yapışma, bakterilerin diğer hücrelere veya yüzeylere bağlandığı bir işlemdir. Bakteriyel patojenler tarafından enfeksiyonun başarılı bir şekilde kurulması, konak hücrelere yapışıklık, dokuların kolonizasyonu ve bazı durumlarda konak hücrelerin istilası1,2,3gerektirir. Ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, son COVID-19 pandemisi4,5,6tarafından kanıtlanan büyük halk sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Daha da önemlisi, yeni veya gelişmekte olan patojenler genomik tabanlı yaklaşımlar kullanılarak kolayca ayırt edilemeyebilir, özellikle patojenin tespit edilmekten kaçınmak için tasarlandığı veya patojenik olarak tanımlayan genomik imzalar içermediği durumlarda. Bu nedenle, konak hücrelere bakteriyel yapışım gibi patojenliğin ayırt edici özelliklerini doğrudan değerlendiren yöntemler kullanılarak potansiyel patojenlerin tanımlanması patojen tanımlamasında kritik bir rol oynayabilir.
Konak hücrelere bakteriyel yapışma, onlarca yıldır bakteriyel patogenez mekanizmalarını değerlendirmek için kullanılmıştır1,7. Mikroskobik görüntüleme8,9 ve bakteriyel koloni oluşturan ünitenin (CFU) 10 ,11,12,13 enfeksiyon sonrası kaplama ile numaralandırılması, konak hücrelerin mikrobiyal yapışma ve/veya enfeksiyonunu test etmek için iyi geliştirilmiş iki laboratuvar yöntemidir14. Bakteri hücrelerinin mikrometre ölçek büyüklüğü göz önüne alındığında, yapışık bakteri hücrelerinin numaralandırılması genellikle gelişmiş yüksek büyütme mikroskopi tekniklerinin yanı sıra elektron mikroskopisi, genleşme mikroskopisi (ExM)15,16ve üç boyutlu görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılmasını gerektirir17 . Alternatif olarak, konak hücrelere bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin numaralandırması, hasat edilen bakterilerin seyreltme serisini katı agar üzerine kaplayarak ve sonuçta elde edilen CFO'lar10 , 12,13sayarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem zahmetlidir ve yüksek verimli analizler için gerekli standartlaştırılmış veya otomatik bir prosedür oluşturmada zorluklar getiren birçok manuel adım içerir18,19. Bu nedenle, konak hücre ekini değerlendirmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi alandaki geçerli sınırlamaları giderir.
Burada, yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birlikte otomatik yüksek verimli mikroskopi kullanan bu tür bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşımı göstermek için, pseudomonas aeruginosada dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel patojenlerle deneyler yapıldı, insanların, hayvanların ve bitkilerin fırsatçı bir Gram-negatif bakteriyel patojeni14,20, sık sık konak savunma fonksiyonları bozulmuş hastaların solunum yollarını kolonileştirdiği tespit edildi. Bu yaklaşım, önceki çalışmalarda açıklanan mikroskobik görüntüleme sürecini optimize etti14,20. Görüntüleme algılaması, floresan etiketli konak hücreler ve bakteriler tarafından, bunların yakınlığını hızla izlemek için basitleştirildi ve bu da bakterileri ayırt etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskopi iş yükünü önemli ölçüde azalttı. Buna ek olarak, konak hücre ve bakterilerin sayımındaki görüntülerin otomatik istatistiksel analizi, konak hücre başına yapışık bakteri sayısının oranını tahmin etmek için bakteriyel CFU kaplamanın elden deneyinin yerini almıştır. Bu yöntemin uyumluluğunu doğrulamak için Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ve Klebsiella pneumoniae gibi birden fazla bakteri türü ve konak hücre tipinin yanı sıra insan göbek ve damar endotel hücreleri (HUVEC) de test edilmiştir ve sonuçlar yöntemin çeşitliliğini ve etkinliğini desteklememektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x PBS</td>
			<td >VWR</td>
			<td >45001-130</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>Host cell staining dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >3882</td>
			<td>Half area well, flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >CCL 185</td>
			<td>Mammalian cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BactoView Live Red</td>
			<td >Biotium</td>
			<td >40101</td>
			<td>Bacteria staning dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CFSE cell division tracker</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >423801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td >BioTek</td>
			<td >Cytation 5&#160;</td>
			<td>Cell imaging multi-mode reader</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E. coli</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGM bulletKit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3124</td>
			<td>HUVEC cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-12k medium</td>
			<td >ATCC&#160;</td>
			<td >302004</td>
			<td>A549 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Corning</td>
			<td >35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HUVEC</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Laboratory stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L. monocytogenes</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OD600 DiluPhotometer</td>
			<td >IMPLEN</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P. aeruginosa &#916;pilA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Dr. Lori Burrows laboratory stock</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. agalactiae</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-46543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. aureus &#916;saeR</td>
			<td >BEI</td>
			<td >NR-48164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S. rubidaea</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >NIST collections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Typical soy broth</td>
			<td >Growcells</td>
			<td >MBPE-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated, high-throughput detection of bacterial adherence to host cells

Ortaya çıkan bakteriyel patojenlerin tanımlanması insan sağlığı ve güvenliği için kritik öneme sahiptir. Konak hücrelere bakteriyel yapışmak bakteriyel enfeksiyonlarda önemli bir adımdır ve potansiyel tehdidin ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bakterilerin konak hücrelere yapışmasını incelemek bakteri tehdidi değerlendirmesinin bir bileşeni olarak kullanılabilir. Konak hücrelere bakteri yapışmasını numaralandırmak için standart bir yöntem, bakterileri konak hücrelerle birlikte kuluçkaya yatırmak, yapışık bakterileri hasat etmek, hasat edilen hücreleri katı ortamda kaplamak ve ardından elde edilen koloni oluşturan birimleri (CFU) saymaktır. Alternatif olarak, konak hücrelere bakteriyel yapışma immünoforezans mikroskopi tabanlı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımları uygulamak için geleneksel stratejiler zaman alıcı ve verimsizdir. Burada yakın zamanda geliştirilen otomatik floresan mikroskopi tabanlı görüntüleme yöntemi açıklanmıştır. Yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birleştirildiğinde, yöntem konak hücrelere yapışan bakterilerin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlar. Protokolü göstermek için gram negatif Pseudomonas aeruginosa ve Gram-pozitif Listeria monocytogenes ve buna karşılık gelen negatif kontroller olmak üzere iki bakteri türü test edildi. Sonuçlar, bu yaklaşımın yapışan bakterileri hızlı ve doğru bir şekilde numaralandırmasını ve deneysel iş yüklerini ve zaman çizelgelerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Floresan görüntüleme bazlı bakteriyel yapışma testini geliştirmek için, P. aeruginosa suşu PAO1 ve negatif yapışma muadili E. coli, protokol etkinliğini test etmek için kullanıldı, çünkü bu bakterilerin A549 hücrelerine yapışma14,20,22bildirilmiştir. İlk olarak, GFP etiketli P. aeruginosa (PAO1) ve GFP etiketli E. coli, sırasıyla çeşitli MOI'lerde insan ölümsüzle?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells at JoVE.com

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Bu yöntem, konak hücrelere bakteri yapışmasının hızlı ve yüksek verimli bir şekilde algılanmasını sağlar. Geleneksel kaplama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, yapışık bakterilerin nicelleştirilmesi için gereken uygulamalı süreyi azaltır. Bu teknik otomatik, zaman kazandıran ve çok tekrarlanabilir.Ayrıca, konak hücrelerin çoğuna da yaygın olarak uygulanır. Bu yöntem, çok basittir. İlk deneme için, enfeksiyonun çokluğu ve ayrıca konak bakteri ortak kuluçka süresi gibi koşullar optimize edilmelidir.İlk önce bakteri kültürlerini üstel bir fazda oda sıcaklığında iki dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleme ile hasat edin. Hücre paletini bir mililitre PBS ile yıkadıktan sonra bakteri paletini bir mililitre PBS'de yeniden biriktirin. 600 nanometrede optik yoğunluğu ölçerek bakteriyel süspansiyon konsantrasyonlarını belirleyin.Daha sonra, bakteri süspansiyonunu boyamak için, boyayı bir kat seyreltmek için bir mililitre bakteri süspansiyonuna 500 kat konsantre stok yeşili veya kırmızı boyama boyasının iki mikrolitresini ekleyin. Karanlıkta hafif dönüş ile hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya bırakın. 30 dakika sonra, lekeli bakterileri iki dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin ve peleti bir mililitre PBS'de yeniden diriltin.Lekeli bakteri hücrelerini iki dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın. Peletin bir mililitrelik taze F12 K ortamında yeniden kullanılabilir ve her kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün. Daha sonra, enfeksiyonun çokluğuna ve konak hücre konsantrasyonuna bağlı olarak kültürleri istenen konsantrasyonlara seyreltin.Bakteriyel Bağlılık Tahlilleri için, her kuyuya 100 mikrolitre sıcak PBS ekleyerek ve yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyerek daha önce kültürlenmiş A549 hücre mono katmanlarını üç kez yıkayın. Ardından PBS'yi atın. Alternatif olarak, PBS ekledikten sonra 10 saniye bekleyin ve ardından vakum kullanarak PBS'yi çıkarın.Bakteriyel ilişkinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı enfeksiyon çokluğuna sahip 100 mikrolitrelik bakteriyel süspansiyon konsantrasyonu ile kaplar. Bakterileri aşağı çevirin ve enfekte olmuş A549 hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksiti bir saat daha kuluçkaya yatırın. Mono katmanları gösterildiği gibi sıcak PBS ile beş kez yıkayarak ilişkisiz bakterileri temizleyin.Daha sonra, buzdaki 96 kuyu plakasının tüm kuyularına% 4 formaldehitten oluşan 100 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitleyin. 15 dakika sonra, sabitleme çözeltisini çıkarmak için plakayı PBS ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI lekesi başına 50 nanogram ile çekirdekte leke.Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, kurumasını önlemek için enfekte olmuş A549 hücrelerini 100 mikrolitre PBS ile örtün ve ardından plakayı karanlıkta iki güne kadar dört santigrat derecede saklayın veya görüntüleme için devam edin. Veri bütünlüğünü korumak için, görüntüleri 20 kat büyütmede yakalamak için her kuyunun beş konumunu rastgele ve manuel olarak seçin. GFP kanalları altında bakterilerin floresan görüntülerini, DAPI altında A549 hücrelerini yakalayın ve kırmızı floresan boya ile lekelenen bakteriler için PE Si beş kanal kullanın.Yumuşatma için yuvarlanan topun parametrelerini ayarlayın ve daha iyi çözünürlük elde etme hedefine göre görüntü dekonvolüyonunun nokta yayma işlevini otomatik olarak ölçün. Konak hücrelerin ve bakterilerin floresan yoğunluğunu ölçün. Konak hücrelerin ve bakterilerin en zayıf floresan yoğunluğunu hücre sayısı eşikleri olarak ayarlayın ve 15 mikrometre mesafedeki bir konak hücreye yakın olan tüm bakterileri yapışma bakterisi olarak sayın.Hücreler tüm otomatik görüntülerden sayıldıktan sonra, konak hücre sayıları, hücre boyutları ve şekilleri, toplam bakteri sayısı ve bakteriyel yapışma belirlemek için en önemli gösterge olan konak hücre başına ortalama bakteri hesabı gibi kritik okumaları analiz edin. Bir saatlik ko inkübasyondan sonra, pseudomonas aeruginosa strain PAO1, A549 hücrelerine doza bağımlı bir şekilde yapıştı. Gram-pozitif bakteri listeria monocytogenes ve negatif kontrol basili subtilis olduğunda da benzer sonuçlar gözlenmiştir.Konak yapışan P aeruginosa segmentasyonunun temsili bir görüntüsü, bu protokolü kullanarak bakteri hücrelerini sayma kolaylığını göstermektedir. Otomatik analizlerin sonuçları bakteriyel ve konak hücre sayılarını, konak hücre başına ortalama bakteri sayısını ve konak hücre sağlığının durumunu temsil eden konak hücre boyutlarını ve alanlarını, bakteriyel yapışma seviyesini ve bakteriyel sito toksisitesini içerir. A549 hücreleri dışında HUVEC'ler de bağlılık testi için test edildi.Serratia rubidaea ve streptococcus agalactiae HUVEC'e bağlıydı, ancak A549 hücrelerine bağlı değildi ve bu yöntemi kullanarak birden fazla konağın konak bakteri etkileşimlerini incelemek için etkili bir şekilde tespit edildiğini ve uygunluğunu göstermektedir. Konak hücreler, kuyuların dibine istenmeyen bakteri yapışmasını en aza indirmek için yaklaşık% 90 ila% 100 birışıklığa ulaşmalıdır. Bu teknik, araştırmacıların yeni mekanizmaları, konak-haşere etkileşimlerini keşfetmelerini sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...