Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

我们感谢Herzik实验室成员对这份手稿和视频内容的批判性思考和反馈。M.A.H.Jr.由NIH R35 GM138206和Searle学者提供支持。H.P.M.N由分子生物物理学培训补助金（NIH T32 GM008326）提供支持。我们还要感谢斯克里普斯研究所的Bill Anderson，Charles Bowman和Gabriel Lander博士帮助设计，组装和测试视频中显示的手动柱塞。

1. 准备手动插孔环境
注：预计运行时间：5-30 分钟
<ol><li>将手动柱塞放置在4°C的冷室中，加湿器可以放在同一位置，以保持房间接近100%相对湿度（RH）（图1A）。 注意：请查阅机构的环境健康和安全指南，了解手动柱塞的安全位置和建议的操作。</li>
	<li>在准备电网之前，打开冷室中的加湿器，以确保冷室的RH≥95%。 注：低湿度下的网格制备可能?...

通过单颗粒低温电子显微镜（cryoEM）对用于成像的生物标本进行玻璃化仍然是成功进行结构测定的关键步骤。该协议中描述的手动印迹和切入方法代表了一种经济高效，可靠且可靠的方法，用于在玻璃体冰薄膜中快速冷冻生物样品以进行冷冻EM成像。使用手稿中概述的方法，研究人员将能够组装和操作手动柱塞，制备适用于闪冻生物样品的冷冻剂，并手动印迹和插入含有生物标本的EM网格。虽然这...

单粒子低温电子显微镜（cryoEM）是一种强大的结构技术，可用于将动态生物标本的结构求解为近原子分辨率1，2，3，4。事实上，直接电子探测器技术的最新进展4，5，6，7，8，9，10，电子源的改进4，11，12，13，14和电磁透镜稳定性15，以及数据采集的持续发展16，17 和分析软件包18，19使研究人员能够常规地确定性能良好的标本的结构，分辨率为3 Å或更好4，11，13，14，20，21，22，23.尽管这些改进了成像和数据处理能力，但冷冻电镜网格准备仍然是成功进行高分辨率结构测定的最大障碍，并且经常成为EM工作流程中相当大的瓶颈24，25，26，27。
CryoEM依赖于对水溶液中的生物样品进行成像，这些溶液被冷冻以形成"玻璃状"冰的薄膜 - 这一过程称为玻璃化 - 保留了天然生化状态。用于冷冻电镜的生物样品的玻璃化可追溯到40多年前28，29，30，为该过程开发的许多技术和设备都依赖于最初详细的印迹和暴跌法31，32，33，34，35，其中将少量样品（例如，1-5μL）施加到专用的EM网格上，然后使用网格与转印纸的物理相互作用去除多余的溶液。该过程的时间通常由经验确定，因为冷冻样品的关键组成部分是玻璃体冰膜的厚度 - 如果冰太厚，则成像质量会由于电子束的散射增加而急剧下降，而太薄的冰会限制蛋白质取向和/或从网格箔孔的中心排除颗粒36.这种对单颗粒冷冻机电偶术完美冰厚的依赖导致了可以冷冻样品的各种技术和设备，包括机器人37，38，微流体42和超声波或喷涂设备27，39，40，41，42，43，44.近年来，一些最流行的样品制备设备依赖于使用机器人技术，使用印迹和暴跌技术自动冷冻样品45。虽然这些设备旨在可重复地为成像创建适当的冰厚度，但它们通常对于单个实验室来说仍然过于昂贵，并且通常以每小时的使用费率在cryoEM设施中找到。近年来，最初的手动印迹和插孔技术已重新投入使用3，47，48，49，50，51，52。事实上，手动操作的印迹和插孔设备可以实现高质量的冷冻EM网格，而成本只是机器人对应物的一小部分。此外，手动印迹还为用户提供了对印迹的更多控制，因为研究人员可以根据每个单独的样品和研究问题调整印迹类型（即网格的反转印，网格的前印转印等）和印迹时间。
在本文中，我们将详细介绍如何使用传统的手动转印和骤入式玻璃化装置以及定制设计的杜瓦瓶平台53来有效冷冻生物样品。提供了最佳实践，包括冷冻剂的制备、网格处理、样品应用和印迹，以及常见的陷阱和如何克服这些障碍的建议。讨论了如何提高网格制备之间的冰厚度再现性以及如何根据生物样品类型修改样品印迹的建议。鉴于本手稿中描述的手动柱塞的购买和操作成本低廉，全球的实验室可以以具有成本效益和可重复的方式为冷冻电镜制备生物标本。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

通过单颗粒低温电子显微镜（cryoEM）用电子成像生物标本以进行高分辨率结构测定，需要一层含有目标生物分子的玻璃体冰薄层。尽管近年来有许多技术进步将单颗粒冷冻电镜推向了结构生物学的前沿，但对标本进行玻璃化以进行高分辨率成像的方法通常仍然是限速步骤。尽管最近的许多努力为克服样品玻璃化过程中经常遇到的障碍提供了手段，包括开发新型样品支架和创新的玻璃化仪器，但由于购买成本低且易于操作，传统的手动操作柱塞仍然是cryoEM社区的主要产品。在这里，我们提供了使用标准的断头台式手动印迹和插孔装置对生物标本进行玻璃化的详细方法，以便通过单颗粒冷冻EM进行高分辨率成像。此外，还描述了标准制备未能产生合适样品时经常遇到的问题和故障排除建议。

成功执行此处描述的印迹和暴跌方案将导致一层薄而均匀的玻璃体冰，该玻璃体冰层没有任何六角形冰，污染物和可以在电子显微镜下观察到的大梯度不可用的冰（图3）。转印纸与网格表面的接触不一致、过早取下印迹纸或在网格接触期间移动印迹纸都会降低玻璃体冰的质量，并导致整个EM网格上的冰厚度不一致（图4）
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

本手稿概述了手动冷冻生物标本以进行单颗粒低温电子显微镜的印迹和暴跌方法。

用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本的手动印迹和切入式冷冻

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

这里描述的手动切入法是制备用于透射电子显微镜样品的具有成本效益的可靠方法。在本视频中，我们将演示如何设置手动柱塞，准备冷冻剂，以及执行EM网格的手动印迹和陷印。准备手动插孔环境。此过程应在湿度大于95%的40摄氏度的冷藏室中进行，我们建议使用此处显示的材料以及在线协议中所述的手动转印和插入。准备低温杜瓦瓶和手动柱塞。要组装低温杜瓦瓶，首先将平台底座安装在蓝色聚苯乙烯泡沫塑料杜瓦瓶的底部，确保其平坦且水平。然后将乙烷容器支架放在平台底座的顶部，并插入黄铜乙烷容器。最后，设置旋转网格存储平台。接下来，将坠落的杜瓦瓶定位到手动柱塞的底部。将乙烷容器置于沉入臂下方，并将沉入式杜瓦瓶固定在底座上。要设置手动跳入高度，请首先将新胶带固定在插孔臂的底部。接下来，通过将胶带牢固地缠绕在插孔臂和镊子底座上来固定一对夹紧镊子。轻轻敲击镊子，确保镊子牢固地固定。握住下陷臂，通过踩下脚踏板，将镊子慢慢放入黄铜乙烷容器中。调整沉入杜瓦瓶的位置，使镊子位于黄铜乙烷容器的中间。镊子的尖端不应接触黄铜乙烷容器的尺寸或底部，以免损坏镊子和手动柱塞。设置位置后，重置手动插臂。准备冷冻剂。应在通风良好的房间内进行冷冻剂制备，并应始终佩戴适当的个人防护装备。首先，劣质液氮直接进入杜瓦瓶，当液氮水平达到黄铜乙烷容器的顶部时停止。系统应足够冷，以便在液氮停止剧烈冒泡后继续进行。这大约需要五分钟。乙烷是一种压缩气体，需要冷凝。要设置气流以获得最佳乙烷冷凝，请将乙烷气体管路的尖端插入250密耳的水烧杯中并观察气泡。气流应产生稳定的气泡流，不会剧烈破坏水面。要开始冷凝乙烷，请将乙烷气体管路的尖端放在黄铜乙烷容器的底部。慢慢搅拌金属尖端，开始液化乙烷。一旦乙烷开始冷却，它就会发出可听见的声音。将黄铜乙烷容器装满四分之三的液体乙烷。用液氮填充沉入式杜瓦瓶，确保它接触到黄铜乙烷容器，但不会溅入其中。液氮的添加对于均匀的乙烷冷冻是必要的。将泡沫盖放在蓝色的杜瓦瓶上，让乙烷完全凝固。重新启动乙烷气流，并小心地将气体管路的尖端放入固体乙烷中。将尖端垂直放入容器中并在底部分配乙烷非常重要。缓慢搅拌金属尖端以熔化乙烷，并将液态乙烷的水平提升到容器的顶部。盖上盖子约一分钟，让乙烷在黄铜容器的边缘周围凝固，直到看到两到三毫米的固体乙烷。乙烷现在处于冷冻生物样品的理想温度。将坠落的杜瓦瓶小心地固定在手动柱塞的底座上。通过将胶带牢固地缠绕在插孔臂和镊子底座上来固定一对夹紧镊子。握住下陷臂，通过踩下脚踏板，将镊子慢慢降低到液态乙烷中。调整沉入杜瓦瓶的位置，使镊子位于液态乙烷的中间，避免与固体乙烷环接触。准备插孔材料和附件。通过将每个圆形滤纸切割成约一厘米宽的条带来准备印迹纸。避免触摸吸墨纸的中心，并丢弃较小的端部。重要的是要确保吸墨纸条干燥、干净且无污染物。在跳入之前，将网格盒放入插入的杜瓦瓶中，放入适当的插槽中。确保网格覆盖我们自由旋转。通过骤降冷冻准备冷冻电镜标本。由于网格和网格准备的多样性，请遵循推荐的使网格亲水的协议。为了正确处理网格，请使用干净、干燥的夹紧镊子拾取外圈处的亲水网格。滑动塑料夹以固定网格，然后轻轻敲击镊子以确保正确夹紧网格。将三微升样品施加到夹紧镊子中固定的网格前面。通过将胶带缠绕在镊子底座上，将镊子牢固地固定在手动插臂上。样品现在已准备好进行吸墨和冷冻。将干净的吸墨纸条的每一端夹在食指和拇指之间。将双手放在坠落的杜瓦瓶的边缘，以建立稳定的位置。印迹纸应距离网格表面约一厘米。弯曲吸墨纸，直到中心接触到网格。重要的是，印迹纸应平行于网格表面，以便均匀接触并防止网格损坏。当移动液体前部停止扩散时，开始计数。擦拭网格五秒钟。将手指分开，拉紧吸印纸，然后迅速将其从网格表面取出。同时，踩下脚踏板以释放手动插臂，将固定网格的镊子插入液体乙烷中。将刚冻结的网格保持在液体乙烷中，小心地将镊子从手动插臂上取下。小心地解开镊子，使网格可拆卸。将网格移动到黄铜乙烷容器下方的液氮储罐中，从乙烷到液氮的快速运动。将网格放置在网格框中。具有代表性的结果。从这个视频中，研究人员应该能够准备像这样的CryoEM网格，其中许多方块含有玻璃体冰的薄膜，用于高分辨率成像。可以调整样品浓度和转印时间以优化颗粒密度。在这里，我们将演示使用印迹和暴跌法冷冻冷冻冷冻EM样品的完整工作流程。使用干净的夹紧镊子拾取新的网格并将网格固定到位。将三微升样品涂在网格的亲水性一侧，并通过将胶带缠绕在镊子手柄上，将镊子固定在手动插臂上。将印迹纸平行于网格表面放置，然后轻轻地将印迹纸向网格弯曲以启动印迹。在所需的时间之后，以快速的动作将吸墨纸从网格表面移开，同时踩下脚踏板以释放下陷臂，将网格插入液体乙烷中。小心地从镊子和手动插臂周围松开胶带。只需快速移动一下，即可将网格从乙烷容器快速转移到液氮储液槽中。将网格放入网格存储盒中，并将镊子包裹在Kim Wipe中晾干;重复。

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