Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

We bedanken de Herzik-lableden voor het kritisch nadenken en het geven van feedback op dit manuscript en de video-inhoud. M.A.H.Jr. wordt ondersteund door NIH R35 GM138206 en als Searle Scholar. H.P.M.N wordt ondersteund door de Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). We willen ook Bill Anderson, Charles Bowman en Dr. Gabriel Lander van het Scripps Research Institute bedanken voor hun hulp bij het ontwerpen, assembleren en testen van de handmatige plunjer die in de video wordt getoond.

1. Bereid de handmatige stortomgeving voor
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 5-30 minuten
<ol><li>Plaats de handmatige zuiger in een koude ruimte van 4 °C waar een luchtbevochtiger kan worden geplaatst om de ruimte dicht bij 100% relatieve vochtigheid (RV) te houden (figuur 1A). LET OP: Raadpleeg de richtlijnen voor milieuhygiëne en -veiligheid van de instelling voor de veilige locatie van de handmatige zuiger en de aanbevolen bewerkingen.</li>
	<li>Schake...

De vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) blijft een uiterst belangrijke stap voor succesvolle structuurbepaling. De handmatige blot-and-plunge-methode die in dit protocol wordt beschreven, vertegenwoordigt een kosteneffectieve, betrouwbare en robuuste methode voor het snel invriezen van biologische monsters in dunne films van glasachtig ijs voor cryoEM-beeldvorming. Met behulp van de methoden die in het manuscript worden beschreven, kunnen o...

Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is een krachtige structurele techniek die kan worden gebruikt om structuren van dynamische biologische monsters op te lossen tot een bijna atomaire resolutie1,2,3,4. Inderdaad, recente ontwikkelingen in directe elektronendetectortechnologieën4,5,6,7,8,9,10, verbeteringen in elektronenbronnen4,11,12,13,14 en elektromagnetische lensstabiliteit15, gekoppeld aan de voortdurende ontwikkeling van gegevensverzameling 16,17 en analysesoftwarepakketten18,19 hebben onderzoekers in staat gesteld om nu routinematig structuren van goed opgevoede monsters te bepalen tot een resolutie van 3 Å of beter4,11,13,14,20,21,22,23 . Ondanks deze verbeterde beeldvormings- en gegevensverwerkingsmogelijkheden blijft cryoEM-rastervoorbereiding de grootste belemmering voor succesvolle structuurbepaling met hoge resolutie en dient het vaak als een aanzienlijk knelpunt in de EM-workflow24,25,26,27.
CryoEM vertrouwt op de beeldvorming van biologische monsters in waterige oplossingen die worden ingevroren om een dunne film van "glasachtig" ijs te vormen - een proces dat bekend staat als vitrificatie - dat de inheemse biochemische toestand behoudt. Vitrificatie van biologische monsters voor cryoEM dateert van meer dan 40 jaar28,29,30 en veel technieken en apparatuur die voor dit proces zijn ontwikkeld, zijn gebaseerd op de oorspronkelijk gedetailleerde blot-and-plunge-methode31,32,33,34,35 , waarbij een klein volume monster (bijv. 1-5 μL) wordt aangebracht op een gespecialiseerd EM-raster voordat de overtollige oplossing wordt verwijderd met behulp van fysieke interactie van het raster met vloeipapier. De timing van dit proces wordt meestal empirisch bepaald voor elk monster, omdat een cruciaal onderdeel van vriesmonsters de dikte van de glasvochtijsfilm is - als het ijs te dik is, verslechtert de beeldkwaliteit dramatisch als gevolg van verhoogde verstrooiing van de elektronenbundel, terwijl ijs dat te dun is, eiwitoriëntaties kan beperken en / of deeltjes uit het midden van het rasterfoliegaten kan uitsluiten36 . Deze afhankelijkheid van de perfecte ijsdikte voor cryoEM met één deeltje heeft geleid tot een breed scala aan technieken en apparatuur die monsters kunnen bevriezen, waaronder robotica37,38, microfluïdica42 en ultrasone of spuitapparatuur27,39,40,41,42,43,44 . In de afgelopen jaren vertrouwen enkele van de meest populaire monstervoorbereidingsapparaten op het gebruik van robotica voor het automatisch invriezen van monsters met behulp van de blot-and-plunge-techniek45. Hoewel deze apparaten zijn ontworpen om reproduceerbaar de juiste ijsdikte te creëren voor beeldvorming, blijven ze vaak te duur voor individuele laboratoria om te kopen en te bedienen en worden ze over het algemeen gevonden in cryoEM-faciliteiten tegen uurtarieven voor gebruik. In de afgelopen jaren is de oorspronkelijke handmatige blot-and-plunge-techniek weer in gebruik gekomen3,47,48,49,50,51,52. Inderdaad, een handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat kan cryoEM-roosters van hoge kwaliteit bereiken tegen een fractie van de kosten van robotachtige tegenhangers. Bovendien biedt handmatige blotting ook meer controle over blotting, omdat onderzoekers het type blotting (d.w.z. back-blotting van het raster, front-blotting van het raster, enz.) en blottingtijd kunnen aanpassen op basis van elke individuele steekproef en onderzoeksvragen.
In dit artikel geven we details over hoe biologische monsters effectief kunnen worden ingevroren met behulp van een traditioneel handmatig vlek-en-dompel vitrificatie-apparaat in combinatie met een op maat ontworpen dewar-platform53. Best practices, waaronder de voorbereiding van het cryogene, rasterbehandeling, monstertoepassing en blotting, evenals veelvoorkomende valkuilen en aanbevelingen over hoe deze hindernissen kunnen worden overwonnen, worden verstrekt. Advies over het verhogen van de reproduceerbaarheid van de ijsdikte tussen rasterpreparaten en het wijzigen van monstervlekken op basis van het biologische specimentype worden besproken. Gezien de lage kosten die gepaard gaan met de aankoop en bediening van de handmatige plunjer die in dit manuscript wordt beschreven, kunnen laboratoria over de hele wereld biologische monsters op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier voorbereiden op cryoEM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

Het in beeld brengen van biologische monsters met elektronen voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) vereist een dunne laag glasachtig ijs met de biomoleculen van belang. Ondanks tal van technologische ontwikkelingen in de afgelopen jaren die cryoEM met één deeltje naar de voorhoede van de structurele biologie hebben gedreven, blijven de methoden waarmee monsters worden verglaasd voor beeldvorming met hoge resolutie vaak de snelheidsbeperkende stap. Hoewel tal van recente inspanningen middelen hebben geboden om hindernissen te overwinnen die vaak worden ondervonden tijdens het verglaasen van monsters, waaronder de ontwikkeling van nieuwe monstersteunen en innovatieve vitrificatie-instrumenten, blijft de traditionele handmatig bediende plunjer een hoofdbestanddeel in de cryoEM-gemeenschap vanwege de lage aanschafkosten en het bedieningsgemak. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het gebruik van een standaard, guillotine-achtig handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat voor de vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming met hoge resolutie door cryoEM met één deeltje. Daarnaast worden ook veelvoorkomende problemen en aanbevelingen voor het oplossen van problemen beschreven voor wanneer een standaardpreparaat geen geschikt monster oplevert.

Succesvolle uitvoering van het hier beschreven blot-and-plunge-protocol zal resulteren in een dunne, uniforme laag glasachtig ijs die vrij is van hexagonaal ijs, verontreinigingen en grote gradiënten van onbruikbaar ijs die onder de elektronenmicroscoop kunnen worden waargenomen (figuur 3). Inconsistent contact van het vloeipapier met het rasteroppervlak, voortijdig verwijderen van het vloeipapier of het verplaatsen van het vloeipapier tijdens rastercontact kan de kwaliteit van het glasvoch...

Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

De hier beschreven handmatige plunging-methode is een kosteneffectieve, betrouwbare methode voor het voorbereiden van monsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. In deze video laten we zien hoe u de handmatige zuiger instelt, cryogene producten voorbereidt en handmatig vloeien en storten van EM-roosters uitvoert. Bereid de handmatige plunging-omgeving voor.Deze procedure moet worden uitgevoerd in een koelcel die op 40 graden Celsius wordt gehouden met een luchtvochtigheid van meer dan 95%We raden aan de hier getoonde materialen te gebruiken en zoals beschreven in het online protocol voor handmatig schillen en storten. Bereid de cryogene Dewar en Manual Plunger voor. Om het cryogene Dewar te monteren, installeert u eerst de platformbasis aan de onderkant van de blauwe piepschuim Dewar, zodat deze vlak en vlak is.Plaats vervolgens de ethaanvathouder bovenop de platformbasis en plaats het messing ethaanvat. Plaats ten slotte het opslagplatform voor het draaiende raster. Lokaliseer vervolgens de instortende Dewar naar de basis van de handmatige zuiger.Centreer het ethaanvat onder de duikarm en zet de onderduikende Dewar vast aan de basis. Om de handmatige storthoogte in te stellen, bevestigt u eerst verse tape aan de basis van de stortarm. Maak vervolgens een pincet vast door de tape stevig om de stortarm en de pincetbasis te wikkelen.Zorg ervoor dat het pincet stevig is bevestigd door er licht op te tikken. Houd de instortende arm vast en laat het pincet langzaam in het koperen ethaanvat zakken door het voetpedaal in te drukken. Pas de locatie van de instortende Dewar aan, zodat het pincet zich in het midden van het messing ethaanvat bevindt.De uiteinden van het pincet mogen geen contact maken met de grootte of onderkant van het messing ethaanvat om schade aan het pincet en de handmatige zuiger te voorkomen. Zodra de positie is ingesteld, reset u de handmatige stortarm. Bereid het cryogene voor.Cryogene bereiding moet worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen moeten te allen tijde worden gedragen. Om te beginnen, slechte vloeibare stikstof rechtstreeks in de kelderende Dewar, stoppen wanneer het vloeibare stikstofniveau de bovenkant van het messing ethaanvat bereikt. Het systeem moet koud genoeg zijn om door te gaan nadat de vloeibare stikstof stopt met hevig borrelen.Dit duurt ongeveer vijf minuten. Ethaan komt als een gecomprimeerd gas en moet worden gecondenseerd. Om de gasstroom in te stellen voor optimale ethaancondensatie, plaatst u de punt van de ethaangasleiding in een beker van 250 mil water en observeert u het borrelen.De gasstroom moet een gestage stroom bellen produceren die het wateroppervlak niet gewelddadig verstoort. Om te beginnen met het condenseren van ethaan, plaatst u de punt van de ethaangasleiding op de bodem van het messing ethaanvat. Roer langzaam de metalen punt en begin met het vloeibaar maken van het ethaan.Zodra het ethaan begint af te koelen, maakt het een hoorbaar geluid. Vul het messing ethaanvat tot driekwart vol vloeibaar ethaan. Vul de instortende Dewar af met vloeibare stikstof en zorg ervoor dat deze het koperen ethaanvat raakt maar er niet in morst.De toevoeging van vloeibare stikstof is noodzakelijk voor een uniforme ethaanbevriezing. Plaats het schuimdeksel op de blauw plunging Dewar en laat het ethaan volledig stollen. Start de ethaangasstroom opnieuw op en plaats voorzichtig de punt van de gasleiding in het vaste ethaan.Het is belangrijk om de punt verticaal in het vat te plaatsen en ethaan aan de onderkant af te geven. Roer langzaam de metalen punt om het ethaan te smelten en breng het niveau van vloeibaar ethaan naar de bovenkant van het vat. Sluit het deksel ongeveer een minuut en laat het ethaan stollen rond de randen van het messing vat totdat twee tot drie millimeter vast ethaan zichtbaar is.Het ethaan is nu op een temperatuur die ideaal is voor het invriezen van biologische monsters. Bevestig de plunging Dewar voorzichtig aan de basis van de handmatige zuiger. Bevestig een pincet door de tape stevig om de stortarm en de pincetbasis te wikkelen.Houd de inklaparm vast en laat het pincet langzaam in het vloeibare ethaan zakken door het voetpedaal in te drukken. Pas de locatie van de instortende Dewar aan zodat het pincet zich in het midden van het vloeibare ethaan bevindt, waardoor contact met de vaste ethaanring wordt vermeden. Bereid plunging materialen en accessoires voor.Bereid het vloeipapier voor door elk cirkelvormig filtreerpapier in ongeveer een centimeter brede stroken te snijden. Raak het midden van het vloeipapier niet aan en gooi de kleinere stukjes uiteinde weg. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de stroken vloeipapier droog, schoon en vrij van verontreinigingen zijn.Plaats voordat u gaat storten de rasterdozen in de instortende Dewar in de juiste sleuven. Zorg ervoor dat het rooster onze vrij te draaien afdekt. Bereid CryoEM-monsters voor door onderkoeling.Vanwege de diversiteit van raster- en netvoorbereidingen, volg de aanbevolen protocollen voor het hydrofiel maken van de netten. Om de roosters goed te hanteren, gebruikt u een schoon, droog klempincet om de hydrofiele roosters aan de buitenste ring op te pakken. Schuif de plastic klem om het rooster vast te zetten en tik zachtjes op het pincet om ervoor te zorgen dat het rooster goed wordt vastgeklemd.Breng drie microliter monster aan op de voorkant van het rooster dat in het klempincet wordt vastgehouden. Bevestig het pincet stevig aan de handmatige inklaparm door de tape om de pincetvoet te wikkelen. Het monster is nu klaar om te worden uitgeveegd en bevroren te worden gedompeld.Houd elk uiteinde van een schone strook vloeipapier tussen je wijsvingers en duimen. Laat je handen rusten op de rand van de neerstortende Dewar om een stabiele positie in te nemen. Het vloeipapier moet zich ongeveer een centimeter van het oppervlak van het rooster bevinden.Buig het vloeipapier totdat het midden in contact komt met het rooster. Het is belangrijk dat het vloeipapier evenwijdig aan het rasteroppervlak ligt om gelijkmatig contact mogelijk te maken en schade aan het net te voorkomen. Wanneer het mobiele vloeistoffront stopt met verspreiden, begint u met tellen.Dep het rooster gedurende vijf seconden. Knip je vingers uit elkaar, druk het vloeipapier en verwijder het snel van het oppervlak van het rooster. Druk tegelijkertijd op het voetpedaal om de handmatige duikarm los te laten en het pincet dat het rooster vasthoudt in het vloeibare ethaan te storten.Houd het vers bevroren rooster in het vloeibare ethaan en maak het pincet voorzichtig los van de handmatige stortarm. Klem het pincet voorzichtig los zodat het rooster afneembaar is. Verplaats het rooster in het vloeibare stikstofreservoir onder het messing ethaanvat met één snelle beweging van het ethaan naar de vloeibare stikstof.Plaats het raster in het rastervak. Representatieve resultaten. Uit deze video zouden onderzoekers cryoem-rasters moeten kunnen voorbereiden, zoals deze, met veel vierkanten die dunne films glasachtig ijs bevatten voor beeldvorming met hoge resolutie.De monsterconcentratie en de despoettijd kunnen worden aangepast om de deeltjesdichtheid te optimaliseren. Hier zullen we de volledige workflow demonstreren voor het invriezen van CryoEM-monsters met behulp van de blot- en plunge-methode. Gebruik een schoon klempincet om een nieuw rooster op te pakken en het rooster op zijn plaats te houden.Breng drie microliter monster aan op de hydrofiele kant van het rooster en bevestig een pincet op de handmatige stortarm door de tape om de pincetgreep te wikkelen. Plaats het vloeipapier parallel aan het rasteroppervlak en buig het vloeipapier voorzichtig naar het rooster om het dempen te initiëren. Beweeg na de gewenste hoeveelheid tijd het vloeipapier in een knakkende beweging weg van het rasteroppervlak terwijl u het voetpedaal indrukt om de plunging-arm los te laten, waardoor het rooster in het vloeibare ethaan wordt gedompeld.Wikkel de tape voorzichtig af van rond het pincet en de handmatige stortarm. Breng met één snelle beweging het rooster snel over van het ethaanvat naar het reservoir met vloeibare stikstof. Plaats het rooster in de roosteropslagdoos en wikkel het pincet in een Kim Wipe om te drogen; herhaal.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...