Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Herzik d’avoir fait preuve de réflexion critique et d’avoir fourni des commentaires sur ce manuscrit et le contenu vidéo. M.A.H.Jr. est soutenu par NIH R35 GM138206 et en tant que Searle Scholar. H.P.M.N est soutenu par la subvention de formation en biophysique moléculaire (NIH T32 GM008326). Nous tenons également à remercier Bill Anderson, Charles Bowman et le Dr Gabriel Lander du Scripps Research Institute pour leur aide dans la conception, l’assemblage et le test du piston manuel présenté dans la vidéo.

1. Préparez l’environnement de plongée manuelle
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 5-30 minutes
<ol><li>Placez le piston manuel dans une chambre froide à 4 °C où un humidificateur peut être co-localisé pour maintenir la pièce à près de 100 % d’humidité relative (HR) (Figure 1A). ATTENTION : Veuillez consulter les lignes directrices de l’institution en matière de santé et de sécurité environnementales pour connaître l’emplacemen...

La vitrification d’échantillons biologiques pour l’imagerie par microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) reste une étape cruciale pour une détermination réussie de la structure. La méthode manuelle de transfert et de plongée décrite dans ce protocole représente une méthode rentable, fiable et robuste pour congeler rapidement des échantillons biologiques dans de minces films de glace vitrée pour l’imagerie cryoEM. En utilisant les méthodes décrites dans le manuscrit, les cherc...

La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est une technique structurelle puissante qui peut être utilisée pour résoudre des structures d’échantillons biologiques dynamiques à une résolution quasi atomique1,2,3,4. En effet, les progrès récents dans les technologies de détecteurs d’électrons directs4,5,6,7,8,9,10, les améliorations des sources d’électrons4,11,12,13,14 et la stabilité des lentilles électromagnétiques15, associés au développement continu de l’acquisition de données 16,17 et des progiciels d’analyse18,19 ont permis aux chercheurs de déterminer systématiquement les structures de spécimens bien élevés à une résolution de 3 Å ou mieux4,11,13,14,20,21,22,23 . Malgré ces capacités améliorées d’imagerie et de traitement des données, la préparation de la grille cryoEM reste le principal obstacle à la détermination réussie de la structure à haute résolution et constitue souvent un goulot d’étranglement considérable dans le flux de travail EM24,25,26,27.
CryoEM s’appuie sur l’imagerie d’échantillons biologiques dans des solutions aqueuses qui sont congelées pour former un mince film de glace « semblable à du verre » - un processus connu sous le nom de vitrification - qui préserve l’état biochimique natif. La vitrification d’échantillons biologiques pour cryoEM remonte à plus de 40 ans28,29,30 et de nombreuses techniques et équipements développés pour ce processus reposent sur la méthode de transfert et de plongeon initialement détaillée31,32,33,34,35 , par lequel un petit volume d’échantillon (p. ex., 1 à 5 μL) est appliqué sur une grille EM spécialisée avant que la solution excédentaire ne soit éliminée à l’aide de l’interaction physique de la grille avec du papier buvard. Le moment de ce processus est généralement déterminé empiriquement pour chaque échantillon, car un élément essentiel de la congélation des échantillons est l’épaisseur du film de glace vitré - si la glace est trop épaisse, la qualité de l’imagerie se détériore considérablement en raison de la diffusion accrue du faisceau d’électrons, tandis que la glace trop mince peut restreindre l’orientation des protéines et / ou exclure les particules du centre des trous de feuille de grille36 . Cette dépendance à l’épaisseur de glace parfaite pour le cryoEM à particule unique a conduit à un large éventail de techniques et d’équipements capables de congeler des échantillons, notamment la robotique37,38, la microfluidique42 et les appareils à ultrasons ou de pulvérisation27,39,40,41,42,43,44 . Ces dernières années, certains des dispositifs de préparation d’échantillons les plus populaires reposent sur l’utilisation de la robotique pour la congélation automatisée des échantillons à l’aide de la technique de transfert et de plongeon45. Bien que ces dispositifs soient conçus pour créer de manière reproductible une épaisseur de glace appropriée pour l’imagerie, ils restent souvent trop coûteux pour que les laboratoires individuels puissent les acheter et les exploiter et se trouvent généralement dans les installations cryoEM à des taux horaires d’utilisation. Au cours des dernières années, la technique originale de transfert et de plongeon manuel est revenue à une utilisation accrue3,47,48,49,50,51,52. En effet, un dispositif de transfert et de plongeon à commande manuelle peut obtenir des grilles cryoEM de haute qualité à une fraction du coût des homologues robotiques. En outre, le buvard manuel offre également aux utilisateurs un plus grand contrôle sur le buvard, car les chercheurs peuvent ajuster le type de transfert (c.-à-d. le transfert arrière de la grille, le transfert avant de la grille, etc.) et le temps de transfert en fonction de chaque échantillon individuel et des questions de recherche.
Dans cet article, nous fournissons des détails sur la façon de congeler efficacement des échantillons biologiques à l’aide d’un dispositif de vitrification manuelle traditionnelle par transfert et par immersion couplé à une plate-forme dewar conçue sur mesure53. Les meilleures pratiques, y compris la préparation du cryogène, la manipulation de la grille, l’application d’échantillons et le buvard, ainsi que les pièges courants et les recommandations sur la façon de surmonter ces obstacles sont fournies. Des conseils sur la façon d’augmenter la reproductibilité de l’épaisseur de la glace entre les préparations de grille et sur la façon de modifier le buvard d’échantillon en fonction du type d’échantillon biologique sont discutés. Compte tenu du faible coût associé à l’achat et à l’utilisation du piston manuel décrit dans ce manuscrit, les laboratoires du monde entier peuvent préparer des échantillons biologiques pour cryoEM de manière rentable et reproductible.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

L’imagerie d’échantillons biologiques avec des électrons pour la détermination de la structure à haute résolution par microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) nécessite une fine couche de glace vitrée contenant les biomolécules d’intérêt. Malgré les nombreuses avancées technologiques de ces dernières années qui ont propulsé le cryoEM monoparticule à l’avant-garde de la biologie structurale, les méthodes par lesquelles les spécimens sont vitrifiés pour l’imagerie à haute résolution restent souvent l’étape limitante du débit. Bien que de nombreux efforts récents aient fourni des moyens de surmonter les obstacles fréquemment rencontrés lors de la vitrification des échantillons, y compris le développement de nouveaux supports d’échantillons et d’instruments de vitrification innovants, le piston à commande manuelle traditionnelle reste un élément de base dans la communauté cryoEM en raison du faible coût d’achat et de la facilité d’utilisation. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour l’utilisation d’un dispositif de transfert et de plongeon standard de type guillotine à commande manuelle pour la vitrification d’échantillons biologiques pour l’imagerie à haute résolution par cryoEM à particule unique. En outre, les problèmes fréquemment rencontrés et les recommandations de dépannage lorsqu’une préparation standard ne parvient pas à produire un échantillon approprié sont également décrits.

L’exécution réussie du protocole de transfert et de plongeon décrit ici se traduira par une couche mince et uniforme de glace vitrée qui est exempte de toute glace hexagonale, de contaminants et de grands gradients de glace inutilisable qui peuvent être observés au microscope électronique (Figure 3). Un contact incohérent du papier buvard avec la surface de la grille, le retrait prématuré du papier buvard ou le déplacement du papier buvard pendant le contact avec la grille peuve...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Ce manuscrit décrit la méthode de transfert et de plongée pour congeler manuellement des échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique.

Congélation manuelle par transfert et par immersion d’échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

La méthode de plongée manuelle décrite ici est une méthode rentable et fiable pour préparer des échantillons pour la microscopie électronique à transmission. Dans cette vidéo, nous montrerons comment configurer le piston manuel, préparer le cryogène et effectuer un buvard et un plongeon manuels des grilles EM. Préparez l’environnement de plongée manuelle.Cette procédure doit être effectuée dans une chambre froide maintenue à 40 degrés Celsius avec une humidité supérieure à 95%Nous vous recommandons d’utiliser les matériaux indiqués ici et comme décrit dans le protocole en ligne pour le buvard et le plongeon manuels. Préparez le cryogène Dewar et le piston manuel. Pour assembler le cryogène Dewar, installez d’abord la base de la plate-forme au fond de la mousse de polystyrène bleu Dewar, en vous assurant qu’elle est plate et plane.Placez ensuite le porte-récipient à éthane sur le dessus de la base de la plate-forme et insérez le récipient en laiton et en éthane. Enfin, situez la plate-forme de stockage de grille tournante. Ensuite, localisez le Dewar plongeant à la base du piston manuel.Centrez le récipient d’éthane sous le bras plongeant et fixez le Dewar plongeant à la base. Pour régler la hauteur de plongée manuelle, fixez d’abord du ruban adhésif frais à la base du bras plongeant. Ensuite, fixez une paire de pinces à pincer en enroulant solidement le ruban adhésif autour du bras plongeant et de la base de la pince.Assurez-vous que les pinces à épiler sont fermement attachées en les tapotant légèrement. Tenez le bras plongeant et abaissez lentement la pince à épiler dans le récipient en laiton éthane en appuyant sur la pédale. Ajustez l’emplacement du Dewar plongeant de sorte que les pinces à épiler se situent au milieu du récipient en laiton éthane.Les extrémités de la pince à épiler ne doivent pas entrer en contact avec la taille ou le fond du récipient en laiton éthane pour éviter d’endommager la pince à épiler et le piston manuel. Une fois la position réglée, réinitialisez le bras plongeant manuel. Préparez le cryogène.La préparation du cryogène doit être effectuée dans une pièce bien ventilée et un équipement de protection individuelle approprié doit être porté en tout temps. Pour commencer, un mauvais azote liquide directement dans le Dewar plongeant, s’arrêtant lorsque le niveau d’azote liquide atteint le sommet du récipient d’éthane en laiton. Le système doit être assez froid pour continuer après que l’azote liquide cesse de bouillonner violemment.Cela prendra environ cinq minutes. L’éthane se présente sous forme de gaz comprimé et doit être condensé. Pour régler le débit de gaz pour une condensation optimale de l’éthane, insérez l’extrémité de la conduite de gaz éthane dans un bécher d’eau de 250 mil et observez le bouillonnement.Le flux de gaz doit produire un flux constant de bulles qui ne perturbe pas violemment la surface de l’eau. Pour commencer à condenser l’éthane, placez l’extrémité de la conduite de gaz éthane au fond du récipient en laiton ethane. Remuez lentement la pointe métallique et commencez à liquéfier l’éthane.Dès que l’éthane commence à refroidir, il fait un bruit audible. Remplissez le récipient d’éthane en laiton aux trois quarts plein d’éthane liquide. Complétez le Dewar plongeant avec de l’azote liquide, en veillant à ce qu’il touche le récipient en laiton ethane mais ne s’y renverse pas.L’ajout d’azote liquide est nécessaire pour une congélation uniforme de l’éthane. Placez le couvercle en mousse sur le Dewar plongeant bleu et laissez l’éthane se solidifier complètement. Redémarrez le flux de gaz éthane et placez soigneusement l’extrémité de la conduite de gaz dans l’éthane solide.Il est important de placer la pointe verticalement dans le récipient et de distribuer de l’éthane au fond. Remuez lentement la pointe métallique pour faire fondre l’éthane et amener le niveau d’éthane liquide jusqu’au sommet du récipient. Fermez le couvercle pendant environ une minute et laissez l’éthane se solidifier autour des bords du récipient en laiton jusqu’à ce que deux à trois millimètres d’éthane solide soient visibles.L’éthane est maintenant à une température idéale pour la congélation d’échantillons biologiques. Fixez soigneusement le Dewar plongeant à la base du piston manuel. Fixez une pince à épiler en enroulant solidement le ruban adhésif autour du bras plongeant et de la base de la pince.Tenez le bras plongeant et abaissez lentement la pince à épiler dans l’éthane liquide en appuyant sur la pédale. Ajustez l’emplacement du Dewar plongeant de sorte que les pinces à épiler se situent au milieu de l’éthane liquide, en évitant tout contact avec l’anneau éthane solide. Préparez les matériaux et accessoires de plongée.Préparez le papier buvard en découpant chaque papier filtre circulaire en bandes d’environ un centimètre de large. Évitez de toucher le centre du papier buvard et jetez les plus petits embouts. Il est important de s’assurer que les bandes de papier buvard sont sèches, propres et exemptes de contaminants.Avant de plonger, placez les boîtes de grille dans le Dewar plongeant dans les fentes appropriées. Assurez-vous que la grille couvre notre libre de rotation. Préparer les échantillons CryoEM par congélation par immersion.En raison de la diversité des préparations de grille et de grille, suivez les protocoles recommandés pour rendre les grilles hydrophiles. Pour manipuler correctement les grilles, utilisez une pince à épiler propre et sèche pour ramasser les grilles hydrophiles au niveau de l’anneau extérieur. Faites glisser la pince en plastique pour fixer la grille et appuyez doucement sur la pince à épiler pour vous assurer que la grille est correctement serrée.Appliquez trois microlitres d’échantillon à l’avant de la grille maintenue dans la pince à épiler. Fixez fermement la pince à épiler au bras plongeant manuel en enroulant le ruban adhésif autour de la base de la pince. L’échantillon est maintenant prêt à être effacé et plongé congelé.Tenez chaque extrémité d’une bande propre de papier buvard entre vos index et vos pouces. Posez vos mains sur le bord du Dewar plongeant pour établir une position stable. Le papier buvard doit se trouver à environ un centimètre de la surface de la grille.Pliez le papier buvard jusqu’à ce que le centre entre en contact avec la grille. Il est important que le papier buvard soit parallèle à la surface de la grille pour permettre un contact uniforme et éviter d’endommager la grille. Lorsque le front de liquide mobile cesse de se propager, commencez à compter.Épongez la grille pendant cinq secondes. Écartez vos doigts, en tendant le papier buvard et en le retirant rapidement de la surface de la grille. Simultanément, appuyez sur la pédale pour relâcher le bras plongeant manuel, plongeant les pinces à épiler qui maintiennent la grille dans l’éthane liquide.En gardant la grille fraîchement congelée dans l’éthane liquide, détachez soigneusement la pince à épiler du bras plongeant manuel. Débranchez soigneusement la pince à épiler pour que la grille soit amovible. Déplacez la grille dans le réservoir d’azote liquide sous le récipient d’éthane en laiton en un mouvement rapide de l’éthane à l’azote liquide.Placez la grille dans la zone de grille. Résultats représentatifs. À partir de cette vidéo, les chercheurs devraient être en mesure de préparer des grilles CryoEM, comme celle-ci, avec de nombreux carrés contenant de minces films de glace vitrée pour l’imagerie à haute résolution.La concentration de l’échantillon et le temps de buvage peuvent être ajustés pour optimiser la densité des particules. Ici, nous allons démontrer le flux de travail complet pour la congélation des échantillons CryoEM en utilisant la méthode de transfert et de plongée. Utilisez une pince à pince propre pour ramasser une grille fraîche et fixer la grille en place.Appliquez trois microlitres d’échantillon sur le côté hydrophile de la grille et fixez la pince à épiler sur le bras de plongée manuelle en enroulant le ruban adhésif autour de la poignée de la pince. Placez le papier buvard parallèlement à la surface de la grille et pliez doucement le papier buvard vers la grille pour initier le buvard. Après le temps souhaité, déplacez le papier buvard dans un mouvement d’accrochage loin de la surface de la grille tout en appuyant sur la pédale pour libérer le bras plongeant, plongeant la grille dans l’éthane liquide.Déroulez soigneusement le ruban adhésif autour de la pince à épiler et du bras plongeant manuel. D’un seul mouvement rapide, transférez rapidement la grille du récipient d’éthane dans le réservoir d’azote liquide. Placez la grille dans la boîte de rangement de la grille et enveloppez la pince à épiler dans une lingette Kim pour sécher;répétez.

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