Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des Herzik-Labors für kritisches Nachdenken und Feedback zu diesem Manuskript und dem Videoinhalt. M.A.H.Jr. wird von NIH R35 GM138206 und als Searle Scholar unterstützt. H.P.M.N wird durch das Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326) unterstützt. Wir möchten uns auch bei Bill Anderson, Charles Bowman und Dr. Gabriel Lander vom Scripps Research Institute für die Hilfe beim Entwerfen, Zusammenbauen und Testen des im Video gezeigten manuellen Kolbens bedanken.

1. Vorbereiten der manuellen Tauchumgebung
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 5-30 Minuten
<ol><li>Positionieren Sie den manuellen Kolben in einem 4 °C heißen Kühlraum, in dem ein Luftbefeuchter untergebracht werden kann, um den Raum in der Nähe von 100 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) zu halten (Abbildung 1A). ACHTUNG: Bitte konsultieren Sie die Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien der Institution für die sichere Position des manuellen Kolb...

Die Vitrifikation biologischer Proben für die Bildgebung mittels Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) bleibt ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Strukturbestimmung. Die in diesem Protokoll beschriebene manuelle Blot-and-Plunge-Methode stellt eine kostengünstige, zuverlässige und robuste Methode zum schnellen Einfrieren biologischer Proben in dünnen Glaskörpereisschichten für die KryoEM-Bildgebung dar. Mit den im Manuskript beschriebenen Methoden werden die Forscher in der Lage sein, den ...

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine leistungsstarke Strukturtechnik, mit der Strukturen dynamischer biologischer Proben mit nahezu atomarer Auflösung gelöst werden können1,2,3,4. In der Tat, jüngste Fortschritte in der direkten Elektronendetektortechnologien4,5,6,7,8,9,10, Verbesserungen der Elektronenquellen4,11,12,13,14 und elektromagnetische Linsenstabilität15, gepaart mit der kontinuierlichen Entwicklung der Datenerfassung 16,17 und Analysesoftwarepakete18,19 haben es den Forschern ermöglicht, strukturen von gut erzogenen Proben mit einer Auflösung von 3 Å oder besser routinemäßig zu bestimmen4,11,13,14,20,21,22,23 . Trotz dieser verbesserten Bildgebungs- und Datenverarbeitungsfunktionen bleibt die KryoEM-Netzvorbereitung das größte Hindernis für eine erfolgreiche hochauflösende Strukturbestimmung und stellt oft einen erheblichen Engpass im EM-Workflow dar24,25,26,27.
CryoEM beruht auf der Bildgebung biologischer Proben in wässrigen Lösungen, die eingefroren werden, um einen dünnen Film aus "glasartigem" Eis zu bilden - ein Prozess, der als Vitrifikation bekannt ist -, der den nativen biochemischen Zustand bewahrt. Die Vitrifikation biologischer Proben für KryoEM reicht über 40 Jahre zurück28,29,30 und viele Techniken und Geräte, die für diesen Prozess entwickelt wurden, beruhen auf der ursprünglich detaillierten Blot-and-Plunge-Methode31,32,33,34,35 , wobei ein kleines Probenvolumen (z. B. 1-5 μL) auf ein spezialisiertes EM-Gitter aufgebracht wird, bevor die überschüssige Lösung durch physikalische Wechselwirkung des Gitters mit Löschpapier entfernt wird. Der Zeitpunkt dieses Prozesses wird in der Regel empirisch für jede Probe bestimmt, da eine kritische Komponente von Gefrierproben die Dicke des Glaskörpereisfilms ist - wenn das Eis zu dick ist, verschlechtert sich die Abbildungsqualität aufgrund der erhöhten Streuung des Elektronenstrahls dramatisch, während zu dünnes Eis die Proteinorientierungen einschränken und / oder Partikel aus der Mitte der Gitterfolienlöcher ausschließen kann36 . Diese Abhängigkeit von der perfekten Eisdicke für Einzelpartikel-KryoEM hat zu einer breiten Palette von Techniken und Geräten geführt, die Proben einfrieren können, darunter Robotik37,38, Mikrofluidik42 und Ultraschall- oder Sprühgeräte27,39,40,41,42,43,44 . In den letzten Jahren verließen sich einige der beliebtesten Probenvorbereitungsgeräte auf den Einsatz von Robotik zum automatisierten Einfrieren von Proben mit der Blot-and-Plunge-Technik45. Während diese Geräte so konzipiert sind, dass sie reproduzierbar die richtige Eisdicke für die Bildgebung erzeugen, bleiben sie oft zu teuer für den Kauf und Betrieb einzelner Labore und werden im Allgemeinen in KryoEM-Einrichtungen zu Stundensätzen für den Einsatz gefunden. In den letzten Jahren ist die ursprüngliche manuelle Blot-and-Plunge-Technik wieder verstärkt in Gebrauch gekommen3,47,48,49,50,51,52. Tatsächlich kann ein manuell betriebenes Blot-and-Plunge-Gerät qualitativ hochwertige KryoEM-Gitter zu einem Bruchteil der Kosten von Roboter-Gegenstücken erzielen. Darüber hinaus bietet das manuelle Blotting den Benutzern auch mehr Kontrolle über das Blotting, da die Forscher die Art des Blottings (dh Back-Blotting des Gitters, Front-Blotting des Gitters usw.) und die Löschzeit basierend auf jeder einzelnen Probe und Forschungsfragen anpassen können.
In diesem Artikel erfahren Sie, wie biologische Proben mit einer herkömmlichen manuellen Blot-and-Plunge-Verglasungsvorrichtung in Verbindung mit einer speziell entwickelten Dewar-Plattform effektiv eingefroren werden können53. Best Practices, einschließlich der Vorbereitung des Kryogens, der Gitterhandhabung, der Probenanwendung und des Blotting, sowie häufige Fallstricke und Empfehlungen zur Überwindung dieser Hürden werden bereitgestellt. Ratschläge zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Eisdicke zwischen den Gittervorbereitungen und zur Modifikation des Probenlöschens basierend auf dem biologischen Probentyp werden diskutiert. Angesichts der geringen Kosten, die mit dem Kauf und Betrieb des in diesem Manuskript beschriebenen manuellen Kolbens verbunden sind, können Labore auf der ganzen Welt biologische Proben kostengünstig und reproduzierbar für KryoEM vorbereiten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

Die Abbildung biologischer Proben mit Elektronen zur hochauflösenden Strukturbestimmung durch kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) erfordert eine dünne Schicht Glaseis, die die interessierenden Biomoleküle enthält. Trotz zahlreicher technologischer Fortschritte in den letzten Jahren, die die Einzelpartikel-KryoEM an die Spitze der Strukturbiologie gebracht haben, bleiben die Methoden, mit denen Proben für die hochauflösende Bildgebung verglast werden, oft der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt. Obwohl zahlreiche neuere Bemühungen Mittel zur Überwindung von Hürden bereitgestellt haben, die häufig bei der Probenverglasung auftreten, einschließlich der Entwicklung neuartiger Probenträger und innovativer Vitrifikationsinstrumente, bleibt der traditionelle manuell betriebene Kolben aufgrund der niedrigen Anschaffungskosten und der einfachen Bedienung ein Grundnahrungsmittel in der KryoEM-Community. Hier stellen wir detaillierte Methoden für den Einsatz eines standardmäßigen, guillotinenartigen, manuell betriebenen Blot-and-Plunge-Geräts zur Vitrifikation biologischer Proben für die hochauflösende Bildgebung mittels Einzelpartikel-KryoEM zur Verfügung. Darüber hinaus werden häufig auftretende Probleme und Empfehlungen zur Fehlerbehebung für den Fall beschrieben, dass ein Standardpräparat keine geeignete Probe liefert.

Die erfolgreiche Ausführung des hier beschriebenen Blot-and-Plunge-Protokolls führt zu einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aus Glaseis, die frei von hexagonalem Eis, Verunreinigungen und großen Gradienten von unbrauchbarem Eis ist, die unter dem Elektronenmikroskop beobachtet werden können (Abbildung 3). Ein inkonsistenter Kontakt des Löschpapiers mit der Gitteroberfläche, das vorzeitige Entfernen des Löschpapiers oder das Bewegen des Löschpapiers während des Gitterkontakts kann ...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Das hier beschriebene manuelle Tauchverfahren ist ein kostengünstiges, zuverlässiges Verfahren zur Vorbereitung von Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie. In diesem Video zeigen wir, wie sie den manuellen Kolben einrichten, Kryogen vorbereiten und manuelles Blotting und Eintauchen von EM-Gittern durchführen. Bereiten Sie die manuelle Absturzumgebung vor.Dieses Verfahren sollte in einem Kühlraum durchgeführt werden, der bei 40 Grad Celsius mit einer Luftfeuchtigkeit von mehr als 95% gehalten wird. Wir empfehlen die Verwendung der hier gezeigten Materialien und wie im Online-Protokoll beschrieben für manuelles Abtupfen und Eintauchen. Bereiten Sie das Kryogen Dewar und den manuellen Kolben vor. Um das Kryogen Dewar zusammenzubauen, installieren Sie zuerst die Plattformbasis an der Unterseite des blauen Styropor-Dewar, um sicherzustellen, dass es flach und eben ist.Legen Sie dann den Ethanbehälterhalter auf die Plattformbasis und setzen Sie den Messing-Ethanbehälter ein. Platzieren Sie schließlich die rotierende Netzspeicherplattform. Als nächstes suchen Sie den eintauchenden Dewar an der Basis des manuellen Kolbens.Zentriere das Ethangefäß unterhalb des Taucharms und befestige den eintauchenden Dewar an der Basis. Um die manuelle Tauchhöhe einzustellen, befestigen Sie zuerst frisches Klebeband an der Basis des Taucharms. Als nächstes befestigen Sie eine Klemmpinzette, indem Sie das Klebeband sicher um den Taucharm und die Pinzettenbasis wickeln.Stellen Sie sicher, dass die Pinzette fest befestigt ist, indem Sie leicht auf sie klopfen. Halten Sie den Taucharm und senken Sie die Pinzette langsam in das Messing-Ethangefäß, indem Sie das Fußpedal drücken. Stellen Sie die Position des eintauchenden Dewar so ein, dass sich die Pinzette in der Mitte des Messing-Ethangefäßes befindet.Die Spitzen der Pinzette sollten nicht mit der Größe oder dem Boden des Messing-Ethangefäßes in Berührung kommen, um Schäden an der Pinzette und dem manuellen Kolben zu vermeiden. Sobald die Position eingestellt ist, setzen Sie den manuellen Taucharm zurück. Bereiten Sie das Kryogen vor.Die Kryogenpräparation sollte in einem gut belüfteten Raum durchgeführt werden und die richtige persönliche Schutzausrüstung sollte jederzeit getragen werden. Zu Beginn, schlechter flüssiger Stickstoff direkt in den eintauchenden Dewar, stoppt, wenn der flüssige Stickstoffgehalt die Oberseite des Messingethangefäßes erreicht. Das System sollte kalt genug sein, um fortzufahren, nachdem der flüssige Stickstoff aufhört, heftig zu sprudeln.Dies dauert ungefähr fünf Minuten. Ethan kommt als komprimiertes Gas und muss kondensiert werden. Um den Gasstrom für eine optimale Ethankondensation einzustellen, führen Sie die Spitze der Ethangasleitung in ein 250 mil Becherglas Wasser ein und beobachten Sie das Blubbern.Der Gasstrom sollte einen stetigen Strom von Blasen erzeugen, der die Wasseroberfläche nicht gewaltsam stört. Um mit der Kondensation von Ethan zu beginnen, platzieren Sie die Spitze der Ethangasleitung am Boden des Messingethangefäßes. Rühren Sie langsam die Metallspitze um und beginnen Sie, das Ethan zu verflüssigen.Sobald das Ethan zu kühlen beginnt, macht es ein hörbares Geräusch. Füllen Sie das Messing-Ethangefäß zu drei Vierteln mit flüssigem Ethan. Füllen Sie den eintauchenden Dewar mit flüssigem Stickstoff ab und stellen Sie sicher, dass er das Messing-Ethangefäß berührt, aber nicht in dieses eindringt.Die Zugabe von flüssigem Stickstoff ist für ein gleichmäßiges Ethangefrieren notwendig. Legen Sie den Schaumstoffdeckel auf den blau abfallenden Dewar und lassen Sie das Ethan vollständig erstarren. Starten Sie den Ethangasstrom neu und legen Sie vorsichtig die Spitze der Gasleitung in das feste Ethan.Es ist wichtig, die Spitze senkrecht in das Gefäß zu legen und Ethan am Boden abzugeben. Rühren Sie langsam die Metallspitze um, um das Ethan zu schmelzen und den Gehalt an flüssigem Ethan bis zur Oberseite des Gefäßes zu bringen. Schließen Sie den Deckel für etwa eine Minute und lassen Sie das Ethan an den Rändern des Messinggefäßes erstarren, bis zwei bis drei Millimeter festes Ethan sichtbar sind.Das Ethan hat jetzt eine Temperatur, die ideal für das Einfrieren biologischer Proben ist. Befestigen Sie den eintauchenden Dewar vorsichtig an der Basis des manuellen Kolbens. Befestigen Sie eine Klemmpinzette, indem Sie das Klebeband sicher um den Taucharm und die Pinzettenbasis wickeln.Halten Sie den Taucharm fest und senken Sie die Pinzette langsam in das flüssige Ethan, indem Sie das Fußpedal drücken. Stellen Sie die Position des eintauchenden Dewar so ein, dass sich die Pinzette in der Mitte des flüssigen Ethans befindet und den Kontakt mit dem festen Ethanring vermeidet. Bereiten Sie Tauchmaterialien und Zubehör vor.Bereiten Sie das Löschpapier vor, indem Sie jedes kreisförmige Filterpapier in etwa einen Zentimeter breite Streifen schneiden. Vermeiden Sie es, die Mitte des Löschpapiers zu berühren, und entsorgen Sie die kleineren Endstücke. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Löschpapierstreifen trocken, sauber und frei von Verunreinigungen sind.Bevor Sie eintauchen, platzieren Sie die Gitterboxen in den eintauchenden Dewar in den richtigen Schlitzen. Stellen Sie sicher, dass das Gitter unsere freie Rotation abdeckt. Bereiten Sie CryoEM-Proben durch Einfrieren vor.Befolgen Sie aufgrund der Vielfalt der Gitter und der Netzvorbereitungen die empfohlenen Protokolle, um die Gitter hydrophil zu machen. Um die Gitter richtig zu handhaben, verwenden Sie eine saubere, trockene Klemmpinzette, um die hydrophilen Gitter am Außenring aufzunehmen. Schieben Sie die Kunststoffklemme, um das Gitter zu sichern, und klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, um sicherzustellen, dass das Gitter richtig eingespannt ist.Tragen Sie drei Mikroliter Probe auf die Vorderseite des Gitters auf, das in der Klemmpinzette gehalten wird. Befestigen Sie die Pinzette fest am manuellen Taucharm, indem Sie das Klebeband um die Pinzettenbasis wickeln. Die Probe ist nun bereit, gelöscht und eingefroren getaucht zu werden.Halten Sie jedes Ende eines sauberen Streifens Löschpapier zwischen Zeigefinger und Daumen. Legen Sie Ihre Hände auf den Rand des stürzenden Dewar, um eine stabile Position einzunehmen. Das Löschpapier sollte etwa einen Zentimeter von der Oberfläche des Gitters entfernt sein.Biegen Sie das Löschpapier, bis die Mitte das Raster berührt. Es ist wichtig, dass das Löschpapier parallel zur Gitteroberfläche ist, um einen gleichmäßigen Kontakt zu ermöglichen und Gitterschäden zu vermeiden. Wenn sich die mobile Flüssigkeitsfront nicht mehr ausbreitet, beginnen Sie mit dem Zählen.Das Gitter für fünf Sekunden abtupfen. Schnippen Sie mit den Fingern auseinander, belasten Sie das Löschpapier und entfernen Sie es schnell von der Oberfläche des Gitters. Drücken Sie gleichzeitig das Fußpedal, um den manuellen Taucharm loszulassen, und tauchen Sie die Pinzette, die das Gitter hält, in das flüssige Ethan ein.Halten Sie das frisch gefrorene Gitter im flüssigen Ethan und lösen Sie die Pinzette vorsichtig vom manuellen Taucharm. Klemmen Sie die Pinzette vorsichtig ab, damit das Gitter abnehmbar ist. Bewegen Sie das Gitter in das Flüssigstickstoffreservoir unterhalb des Messingethangefäßes mit einer schnellen Bewegung vom Ethan zum flüssigen Stickstoff.Platzieren Sie das Raster im Rasterfeld. Repräsentative Ergebnisse. Aus diesem Video sollten Forscher in der Lage sein, CryoEM-Gitter wie dieses mit vielen Quadraten, die dünne Schichten aus Glaskörpereis enthalten, für hochauflösende Bildgebung vorzubereiten.Die Probenkonzentration und die Blotting-Zeit können angepasst werden, um die Partikeldichte zu optimieren. Hier demonstrieren wir den vollständigen Workflow für das Einfrieren von CryoEM-Proben mit der Blot- und Plunge-Methode. Verwenden Sie eine saubere Klemmpinzette, um ein frisches Gitter aufzunehmen und das Gitter an Ort und Stelle zu sichern.Tragen Sie drei Mikroliter Probe auf die hydrophile Seite des Gitters auf und befestigen Sie die Pinzette am manuellen Taucharm, indem Sie das Klebeband um den Pinzettengriff wickeln. Positionieren Sie das Löschpapier parallel zur Rasteroberfläche und biegen Sie das Löschpapier vorsichtig in Richtung des Rasters, um das Blotting einzuleiten. Bewegen Sie nach der gewünschten Zeit das Löschpapier in einer Schnappbewegung von der Gitteroberfläche weg, während Sie das Fußpedal drücken, um den Taucharm freizugeben, und das Gitter in das flüssige Ethan eintauchen.Ziehen Sie das Klebeband vorsichtig um die Pinzette und den manuellen Taucharm ab. Übertragen Sie mit einer schnellen Bewegung das Gitter schnell aus dem Ethangefäß in das Flüssigstickstoffreservoir. Legen Sie das Gitter in die Gitterspeicherbox und wickeln Sie die Pinzette zum Trocknen in ein Kim Wipe.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...