Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת הרציק על החשיבה הביקורתית ומתן משוב על כתב יד זה ותוכן הווידאו. M.A.H.Jr נתמך על ידי NIH R35 GM138206 וכמלומד סירל. H.P.M.N נתמך על ידי מענק אימון ביופיסיקה מולקולרית (NIH T32 GM008326). ברצוננו גם להודות לביל אנדרסון, צ'ארלס באומן וד"ר גבריאל לנדר במכון המחקר סקריפס על העזרה בתכנון, הרכבה ובדיקה של הבוכנה הידנית המוצגת בסרטון.

1. הכן את סביבת הצלילה הידנית
הערה: זמן פעולה משוער: 5-30 דקות
<ol><li>אתר את הבוכנה הידנית בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס שבו ניתן למצוא מכשיר אדים כדי לשמור על החדר קרוב ל-100% לחות יחסית (RH) (איור 1A). אזהרה: יש להיוועץ בהנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד למיקום בט?...

vitrification של דגימות ביולוגיות להדמיה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית חלקיק יחיד (cryoEM) נשאר צעד חשוב מאוד לקביעת מבנה מוצלחת. שיטת הכתם והצלילה הידנית המתוארת בפרוטוקול זה מייצגת שיטה חסכונית, אמינה וחזקה להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות בסרטים דקים של קרח שרץ להדמיית cryoEM. באמצעות הש?...

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) היא טכניקה מבנית רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפתור מבנים של דגימות ביולוגיות דינמיות לרזולוציה כמעט אטומית1,2,3,4. ואכן, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות גלאי אלקטרונים ישיר4,5,6,7,8,9,10, שיפורים במקורות אלקטרונים4,11,12,13,14 ויציבות עדשה אלקטרומגנטית15, יחד עם המשך הפיתוח של רכישת נתונים 16,17 וחבילות תוכנה לניתוח18,19, אפשרו לחוקרים לקבוע כעת באופן שגרתי מבנים של דגימות מחונכות היטב ל-3 רזולוציה של Å או טוב יותר4,11,13,14,20,21,22,23 . למרות יכולות הדמיה ועיבוד נתונים משופרות אלה, הכנת רשת CryoEM נותרה המכשול הגדול ביותר לקביעת מבנה מוצלח ברזולוציה גבוהה ולעתים קרובות משמשת צוואר בקבוק ניכר בזרימת העבודה EM24,25,26,27.
CryoEM מסתמכת על הדמיה של דגימות ביולוגיות בפתרונות מימיים שהוקפאו כדי ליצור סרט דק של קרח "דמוי זכוכית" - תהליך המכונה vitrification - המשמר את המצב הביוכימי המקומי. Vitrification של דגימות ביולוגיות עבור cryoEM שתחילתה מעל 40 שנים28,29,30 וטכניקות וציוד רבים שפותחו עבור תהליך זה מסתמכים על שיטת blot-and-plunge המפורטת במקור31,32,33,34,35 לפיו נפח קטן של מדגם (למשל, 1-5 μL) מוחל על רשת EM מיוחדת לפני הפתרון העודף מוסר באמצעות אינטראקציה פיזית של הרשת עם נייר סופג., התזמון של תהליך זה נקבע בדרך כלל אמפירית עבור כל דגימה כמרכיב קריטי של הקפאת דגימות הוא עובי סרט הקרח הזגג - אם הקרח סמיך מדי אז איכות ההדמיה מתדרדרת באופן דרמטי עקב פיזור מוגבר של קרן האלקטרונים בעוד קרח דק מדי יכול להגביל את אוריינטציות החלבון ו / או להוציא חלקיקים ממרכז חורי רדיד הרשת36 . הסתמכות זו על עובי הקרח המושלם עבור CryoEM חלקיק יחיד הובילה למגוון רחב של טכניקות וציוד שיכולים להקפיא דגימות, כולל רובוטיקה37,38, microfluidics42, והתקנים קוליים או ריסוס27,39,40,41,42,43,44 . בשנים האחרונות, חלק ממכשירי הכנת הדגימה הפופולריים ביותר מסתמכים על שימוש ברובוטיקה להקפאה אוטומטית של דגימות בטכניקת הכתם והצללה45. בעוד מכשירים אלה נועדו ליצור עובי קרח מתאים להדמיה, לעתים קרובות הם נשארים יקרים מדי עבור מעבדות בודדות לרכוש ולתפעול והם נמצאים בדרך כלל בתוך מתקני cryoEM בתעריפים לשעה לשימוש. בשנים האחרונות, טכניקת הכתם וצלילה הידנית המקורית חזרה לשימוש מוגבר3,47,48,49,50,51,52. ואכן, מכשיר כתם וצלילה המופעל באופן ידני יכול להשיג רשתות קריום באיכות גבוהה בשבריר מהעלות של עמיתים רובוטיים. יתר על כן, סופג ידני גם מציע למשתמשים יותר שליטה על סופג כמו חוקרים יכולים להתאים את סוג של blotting (כלומר, back-blotting של הרשת, החלקה קדמית של הרשת, וכו '), וזמן סופג בהתבסס על כל מדגם בודד ושאלות מחקר.
במאמר זה, אנו מספקים פרטים על איך להקפיא ביעילות דגימות ביולוגיות באמצעות מכשיר vitrification כתם וצלילה ידני מסורתי בשילוב עם פלטפורמת dewar מעוצבת בהתאמה אישית53. שיטות עבודה מומלצות, כולל הכנת קריוגן, טיפול ברשת, יישום מדגם, סופג, כמו גם מלכודות נפוצות והמלצות על איך להתגבר על משוכות אלה מסופקים. עצה כיצד להגדיל את עובי הקרח רבייה בין תכשירי רשת וכיצד לשנות כתמי מדגם בהתבסס על סוג הדגימה הביולוגית נדונים. בהתחשב בעלות הנמוכה הקשורה לרכישה ותפעול של הבוכנה הידנית המתוארת בכתב יד זה, מעבדות ברחבי העולם יכולות להכין דגימות ביולוגיות עבור cryoEM באופן חסכוני וניתן לשחזור.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

הדמיית דגימות ביולוגיות עם אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) דורשת שכבה דקה של קרח זגוגי המכיל את הביומולקולים של עניין. למרות התפתחויות טכנולוגיות רבות בשנים האחרונות שדחפו את CryoEM של חלקיק יחיד לחזית הביולוגיה המבנית, השיטות שבאמצעותן דגימות מתחדשות להדמיה ברזולוציה גבוהה נשארות לעתים קרובות הצעד המגביל את הקצב. למרות שמאמצים רבים שנעשו לאחרונה סיפקו אמצעים להתגבר על משוכות שנתקלו בהן לעתים קרובות במהלך vitrification דגימה, כולל פיתוח של תמיכה מדגם חדשני ומכשור ויטרציה חדשני, הבוכנה המסורתית המופעלת ידנית נשארה מרכיב עיקרי בקהילת cryoEM בשל העלות הנמוכה לרכישה וקלות הפעולה. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לשימוש במכשיר סטנדרטי בסגנון גיליוטינה המופעל באופן ידני כתם וצלילה להתחדשות של דגימות ביולוגיות להדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי קריום חלקיק יחיד. בנוסף, בדרך כלל נתקל בבעיות והמלצות פתרון בעיות כאשר הכנה סטנדרטית נכשלת להניב דגימה מתאימה מתוארים גם.

ביצוע מוצלח של פרוטוקול הכתם והצללה המתואר כאן יביא לשכבה דקה ואחידה של קרח זגוגית, נטולת קרח משושה, מזהמים ושיפועים גדולים של קרח בלתי שמיש שניתן לצפות בהם תחת מיקרוסקופ האלקטרונים (איור 3). מגע לא עקבי של נייר הכתמים עם משטח הרשת, הסרה מוקדמת של נייר הכתם, או הזזת נייר הכתם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

שיטת הצלילה הידנית המתוארת כאן היא שיטה חסכונית ואמינה להכנת דגימות למיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. בסרטון זה, אנו להדגים כיצד להגדיר את הבוכנה הידנית, להכין קריוגן, ולבצע סופג ידני וצלילה של רשתות EM. הכן את סביבת הצלילה הידנית.הליך זה צריך להתבצע בחדר קר המתוחזק ב 40 מעלות צלזיוס עם לחות של יותר מ 95%אנו ממליצים להשתמש בחומרים המוצגים כאן וכפי שתואר בפרוטוקול המקוון עבור סופג ידני וצלילה. הכן את הקריוגן דיואר ואת הבוכנה הידנית. כדי להרכיב את קריוגן דיואר, ראשית להתקין את בסיס הפלטפורמה בתחתית הקלקר הכחול דיואר, להבטיח כי הוא שטוח ורמה.לאחר מכן מניחים את מחזיק כלי האתאן על גבי בסיס הרציף ומכניסים את כלי האתאן מפליז. לבסוף, למקם את פלטפורמת אחסון רשת ספינינג. לאחר מכן, אתר את דיואר צולל לבסיס הבוכנה הידנית.מרכז את ספינת האתאן מתחת לזרוע הצוללת ואבטח את דיואר צולל לבסיס. כדי להגדיר את גובה הצלילה הידני, תחילה חבר סרט טרי לבסיס הזרוע הצוללת. לאחר מכן, הדק זוג פינצטה מהדקת על ידי גלישה מאובטחת של הקלטת סביב הזרוע הצוללת ובסיס הפינצטה.ודא פינצטה מחוברים בחוזקה על ידי הקשה עליהם בקלילות. החזק את זרוע הצלילה והורד לאט לאט את הפינצטה לתוך כלי האתאן מפליז על ידי דיכוי דוושת הרגל. התאם את המיקום של דיואר הצולל כך פינצטה לאתר לאמצע כלי האתאן פליז.קצות פינצטה לא צריך ליצור קשר עם הגודל או התחתון של כלי האתאן פליז כדי למנוע נזק פינצטה בוכנה ידנית. לאחר המיקום מוגדר, לאפס את זרוע הצלילה הידנית. הכן את הקריוגן.הכנת קריוגן צריכה להתבצע בחדר מאוורר היטב וציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק בכל עת. בתור התחלה, חנקן נוזלי עני ישירות לתוך Dewar צולל, עצירה כאשר רמת החנקן הנוזלי מגיע לחלק העליון של כלי האתאן פליז. המערכת צריכה להיות קרה מספיק כדי להמשיך לאחר החנקן הנוזלי מפסיק לבעבע באלימות.זה ייקח בערך חמש דקות. אתאן מגיע כגז דחוס וצריך לדחוס אותו. כדי להגדיר את זרימת הגז עבור עיבוי אתאן אופטימלי, להכניס את קצה קו הגז אתאן לתוך מים 250 מל ולצפות המבעבע.זרימת הגז צריכה לייצר זרם קבוע של בועות שאינו משבש באלימות את פני המים. כדי להתחיל לדחוס אתאן, מניחים את קצה קו הגז אתאן בתחתית כלי האתאן מפליז. מערבבים לאט את קצה המתכת ומתחילים להניך את האתאן.ברגע שהאתאן יתחיל להתקרר, זה יעשה רעש נשמע. מלא את כלי האתאן מפליז לשלושה רבעים מלאים באתאן נוזלי. תמלא את דיואר הצוללת בחנקן נוזלי, מה שמבטיח שהוא ייגע בכלי האתאן מפליז אך לא יישפך לתוכו.תוספת של חנקן נוזלי הכרחית להקפאת אתאן אחידה. מניחים את מכסה הקצף על דיואר הצולל הכחול, ומאפשרים לאתאן להתמצק לחלוטין. הפעל מחדש את זרימת גז האתאן והכניס בזהירות את קצה קו הגז לאתאן המוצק.חשוב למקם את הקצה אנכית לתוך הכלי ולחלק אתאן בתחתית. מערבבים לאט את קצה המתכת כדי להמיס את האתאן ולהביא את רמת האתאן הנוזלי עד לחלק העליון של הכלי. סוגרים את המכסה כדקה ומאפשרים לאתאן להתגבש סביב קצוות כלי הפליז עד שניים עד שלושה מילימטרים של אתאן מוצק נראים.האתאן נמצא כעת בטמפרטורה אידיאלית להקפאת דגימות ביולוגיות. חבר את דיואר צולל בזהירות לבסיס הבוכנה הידנית. הדקו זוג פינצטה מהדקת על ידי עטיפת הסרט סביב הזרוע הצונחת ובסיס הפינצטה.החזק את זרוע הצלילה ולהוריד לאט את פינצטה לתוך האתאן הנוזלי על ידי מדכא את דוושת כף הרגל. התאם את המיקום של Dewar צולל כך פינצטה לאתר לאמצע האתאן הנוזלי, הימנעות ממגע עם טבעת האתאן מוצק. הכן חומרים ואביזרים צוללים.הכן את נייר הכתמים על ידי חיתוך כל נייר סינון עגול לרצועות ברוחב של סנטימטר אחד. הימנעו מלגעת במרכז נייר הכתמים והשליכו את חתיכות הקצה הקטנות יותר. חשוב לוודא כי רצועות הנייר הכתומים יבשות, נקיות וללא מזהמים.לפני הצלילה, מניחים את תיבות הרשת לתוך דיואר צולל לתוך החריצים הנכונים. ודא שהרשת מכסה את היכולת שלנו להסתובב. הכן דגימות CryoEM על ידי הקפאת צלילה.בשל המגוון של רשתות ותכשירי רשת, בצע פרוטוקולים מומלצים לעיבוד הרשתות הידרופיליות. כדי לטפל כראוי ברשתות, השתמש פינצטה נקיה ויבשה כדי להרים את הרשתות ההידרופיליות בטבעת החיצונית. החלק את מלחצי הפלסטיק כדי לאבטח את הרשת והקש בעדינות על פינצטה כדי להבטיח שהרשת מהודקת כראוי.החל שלושה microliters של מדגם על החלק הקדמי של הרשת מוחזק פינצטה מהדק. חברו את הפינצטה בחוזקה לזרוע הצלילה הידנית על ידי עטיפת הקלטת סביב בסיס הפינצטה. המדגם מוכן כעת להימחק ולצלל קפוא.החזק כל קצה של רצועה נקייה של נייר סופג בין האצבעות והאגודלים. הנח את ידיך על קצה דיואר צולל כדי לבסס עמדה יציבה. נייר הכתמים צריך להיות בערך סנטימטר אחד מפני השטח של הרשת.כופפו את נייר הכתמים עד שהמרכז יצור קשר עם הרשת. חשוב כי נייר סופג מקביל משטח הרשת כדי לאפשר מגע אפילו ולמנוע נזק לרשת. כאשר חזית הנוזל הנייד מפסיקה להתפשט, התחל לספור.כתם הרשת במשך חמש שניות. הצמידו את אצבעותיכם לגזרים, מתחו את הנייר המנופח והסירו אותו במהירות מפני השטח של הרשת. בו זמנית, לחץ על דוושת הרגל כדי לשחרר את זרוע הצלילה הידנית, צולל את הפינצטה מחזיקה את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.תוך שמירה על הרשת הקפואה הטרייה באתאן הנוזלי, ניתקו בזהירות את פינצטה מזרוע הצלילה הידנית. בזהירות לבטל את פינצטה כך הרשת נשלפת. העבר את הרשת לתוך מאגר החנקן הנוזלי מתחת לכלי האתאן מפליז בתנועה מהירה אחת מהאיתאן לחנגן הנוזלי.מקם את הרשת בתיבת הרשת. תוצאות מייצגות. מתוך וידאו זה, חוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין רשתות CryoEM, כגון זה, עם ריבועים רבים המכילים סרטים דקים של קרח הזגום להדמיה ברזולוציה גבוהה.ניתן להתאים את ריכוז הדגימה ואת זמן ההחלקה כדי למטב את צפיפות החלקיקים. כאן, אנו להדגים את זרימת העבודה המלאה להקפאת דגימות CryoEM באמצעות שיטת blot וצלילה. השתמש פינצטה מהדק נקי כדי להרים רשת חדשה ולאבטח את הרשת במקום.החל שלושה microliters של מדגם בצד ההידרופילי של הרשת ופינצטה מאובטחת לזרוע הצלילה הידנית על ידי גלישת הקלטת סביב ידית פינצטה. מקם את נייר הכתמים במקביל למשטח הרשת וכופף בעדינות את נייר הכתמים לכיוון הרשת כדי ליזום כתמים. לאחר פרק הזמן הרצוי, הזז את נייר הכתם בתנועת הצמדה הרחק מפני הרשת תוך כדי דיכוי דוושת כף הרגל כדי לשחרר את הזרוע הצוללת, צולל את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.בזהירות לשחרר את הקלטת מסביב פינצטה וזרוע הצלילה הידנית. בתנועה מהירה אחת, העבירו במהירות את הרשת מכלי האתאן למאגר החנקן הנוזלי. מקם את הרשת בתיבת האחסון של הרשת ועטוף את פינצטה ב-Kim Wipe כדי להתייבש;חזור.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...