Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

हम इस पांडुलिपि और वीडियो सामग्री पर गंभीर रूप से सोचने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए हर्ज़िक लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 द्वारा समर्थित है और एक Searle विद्वान के रूप में। H.P.M.N आणविक बायोफिज़िक्स प्रशिक्षण अनुदान (NIH T32 GM008326) द्वारा समर्थित है। हम स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट में बिल एंडरसन, चार्ल्स बोमन और डॉ गैब्रियल लैंडर को वीडियो में दिखाए गए मैनुअल प्लंजर को डिजाइन करने, इकट्ठा करने और परीक्षण करने में मदद करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

1. मैनुअल प्लंजिंग वातावरण तैयार करें
नोट:: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 5-30 मिनट
<ol><li>एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में मैनुअल प्लंजर का पता लगाएं जहां एक ह्यूमिडिफायर को 100% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) (<strong...

एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा इमेजिंग के लिए जैविक नमूनों का विट्रीफिकेशन सफल संरचना निर्धारण के लिए एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण कदम बना हुआ है। इस प्रोटोकॉल में वर्?...

एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एक शक्तिशाली संरचनात्मक तकनीक है जिसका उपयोग गतिशील जैविक नमूनों की संरचनाओं को निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 1,2,3,4 तक हल करने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति4,5,6,7,8,9,10, इलेक्ट्रॉन स्रोतों में सुधार4,11,12,13,14, और विद्युत चुम्बकीय लेंस स्थिरता15, डेटा अधिग्रहण के निरंतर विकास के साथ युग्मित 16,17 और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज18,19, ने शोधकर्ताओं को अब नियमित रूप से 3 Å रिज़ॉल्यूशन या बेहतर 4,11,13,14,20,21,22,23 के लिए अच्छी तरह से व्यवहार किए गए नमूनों की संरचनाओं को निर्धारित करने में सक्षम बनाया है . इन बेहतर इमेजिंग और डेटा प्रसंस्करण क्षमताओं के बावजूद, क्रायोईएम ग्रिड तैयारी सफल उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए सबसे बड़ी बाधा बनी हुई है और अक्सर ईएम वर्कफ़्लो 24,25,26,27 में काफी बाधा के रूप में कार्य करती है।
क्रायोईएम जलीय समाधानों में जैविक नमूनों की इमेजिंग पर निर्भर करता है जो "कांच की तरह" बर्फ की एक पतली फिल्म बनाने के लिए जमे हुए हैं - एक प्रक्रिया जिसे विट्रीफिकेशन के रूप में जाना जाता है - जो देशी जैव रासायनिक राज्य को संरक्षित करता है। क्रायोईएम के लिए जैविक नमूनों का विट्रिफिकेशन 40 वर्षों से अधिक है28,29,30 और इस प्रक्रिया के लिए विकसित की गई कई तकनीकें और उपकरण मूल रूप से विस्तृत धब्बा-और-डुबकी विधि पर निर्भर करते हैं31,32,33,34,35 , जिससे नमूना की एक छोटी मात्रा (उदाहरण के लिए, 1-5 μL) को एक विशेष ईएम ग्रिड पर लागू किया जाता है, इससे पहले कि अतिरिक्त समाधान ब्लोटिंग पेपर के साथ ग्रिड की भौतिक बातचीत का उपयोग करके हटा दिया जाए। इस प्रक्रिया का समय आमतौर पर प्रत्येक नमूने के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है क्योंकि ठंड के नमूनों का एक महत्वपूर्ण घटक विट्रियस बर्फ फिल्म की मोटाई है - यदि बर्फ बहुत मोटी है तो इमेजिंग गुणवत्ता इलेक्ट्रॉन बीम के बढ़े हुए बिखरने के कारण नाटकीय रूप से खराब हो जाती है जबकि बर्फ जो बहुत पतली है, प्रोटीन अभिविन्यास को प्रतिबंधित कर सकती है और / या ग्रिड पन्नी छेद के केंद्र से कणों को बाहर कर सकती है36 . एकल-कण क्रायोईएम के लिए सही बर्फ की मोटाई पर इस निर्भरता ने तकनीकों और उपकरणों की एक विस्तृत सरणी का नेतृत्व किया है जो रोबोटिक्स 37,38, माइक्रोफ्लुइडिक्स 42, और अल्ट्रासोनिक या छिड़काव उपकरणों सहित नमूनों को फ्रीज कर सकते हैं27,39,40,41,42,43,44 . हाल के वर्षों में, कुछ सबसे लोकप्रिय नमूना तैयारी उपकरण धब्बा-और-डुबकी तकनीक 45 का उपयोग करके नमूनों के स्वचालित ठंड के लिए रोबोटिक्स के उपयोग पर भरोसा करते हैं। जबकि इन उपकरणों को इमेजिंग के लिए उचित बर्फ की मोटाई बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे अक्सर व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं को खरीदने और संचालित करने के लिए बहुत महंगे रहते हैं और आमतौर पर उपयोग के लिए प्रति घंटा दरों पर क्रायोईएम सुविधाओं के भीतर पाए जाते हैं। हाल के वर्षों में, मूल मैनुअल धब्बा-और-डुबकी तकनीक बढ़ी हुई उपयोग 3,47,48,49,50,51,52 में वापस आ गई है। दरअसल, एक मैन्युअल रूप से संचालित धब्बा-और-डुबकी डिवाइस रोबोट समकक्षों की लागत के एक अंश पर उच्च गुणवत्ता वाले क्रायोईएम ग्रिड प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, मैन्युअल ब्लोटिंग भी ब्लोटिंग पर अधिक उपयोगकर्ताओं को नियंत्रण प्रदान करता है क्योंकि शोधकर्ता ब्लोटिंग के प्रकार को समायोजित कर सकते हैं (यानी, ग्रिड के बैक-ब्लोटिंग, ग्रिड के फ्रंट-ब्लोटिंग, आदि), और प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने और शोध प्रश्नों के आधार पर ब्लोटिंग समय।
इस लेख में, हम एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए डेवर प्लेटफ़ॉर्म 53 के साथ युग्मित पारंपरिक मैनुअल धब्बा-और-डुबकी विट्रीफिकेशन डिवाइस का उपयोग करके जैविक नमूनों को प्रभावी ढंग से फ्रीज करने के तरीके पर विवरण प्रदान करते हैं। क्रायोजेन की तैयारी, ग्रिड हैंडलिंग, नमूना आवेदन, और ब्लोटिंग सहित सर्वोत्तम प्रथाएं, साथ ही साथ इन बाधाओं को दूर करने के तरीके पर सामान्य नुकसान और सिफारिशें प्रदान की जाती हैं। ग्रिड की तैयारी के बीच बर्फ की मोटाई पुनरुत्पादन को बढ़ाने के तरीके और जैविक नमूना प्रकार के आधार पर नमूना ब्लोटिंग को संशोधित करने के तरीके पर सलाह पर चर्चा की जाती है। इस पांडुलिपि में वर्णित मैनुअल प्लंजर की खरीद और संचालन से जुड़ी कम लागत को देखते हुए, दुनिया भर की प्रयोगशालाएं लागत प्रभावी और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से क्रायोईएम के लिए जैविक नमूने तैयार कर सकती हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉनों के साथ इमेजिंग जैविक नमूनों को ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स युक्त विट्रियस बर्फ की एक पतली परत की आवश्यकता होती है। हाल के वर्षों में कई तकनीकी प्रगति के बावजूद, जिन्होंने एकल-कण क्रायोईएम को संरचनात्मक जीव विज्ञान के सबसे आगे धकेल दिया है, जिन तरीकों से नमूनों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए विट्रीफाइड किया जाता है, वे अक्सर दर-सीमित कदम बने रहते हैं। यद्यपि कई हालिया प्रयासों ने नमूना विट्रीफिकेशन के दौरान अक्सर आने वाली बाधाओं को दूर करने के लिए साधन प्रदान किए हैं, जिसमें उपन्यास नमूना समर्थन और अभिनव विट्रीफिकेशन इंस्ट्रूमेंटेशन का विकास शामिल है, पारंपरिक मैन्युअल रूप से संचालित प्लंजर खरीदने और संचालन में आसानी के लिए कम लागत के कारण क्रायोईएम समुदाय में एक प्रधान बना हुआ है। यहां, हम एकल-कण क्रायोईएम द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए जैविक नमूनों के विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक, गिलोटिन-शैली मैन्युअल रूप से संचालित धब्बा-और-डुबकी डिवाइस का उपयोग करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, आमतौर पर समस्याओं का सामना करना पड़ा और समस्या निवारण सिफारिशों के लिए जब एक मानक तैयारी एक उपयुक्त नमूना उपज करने में विफल रहता है, तो भी वर्णित हैं।

यहां वर्णित धब्बा-और-डुबकी प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप विट्रियस बर्फ की एक पतली, समान परत होगी जो किसी भी हेक्सागोनल बर्फ, संदूषकों और अनुपयोगी बर्फ के बड़े ग्रेडिएंट से मुक्त है जिसे इल...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

यह पांडुलिपि एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों को मैन्युअल रूप से फ्रीज करने के लिए धब्बा-और-डुबकी विधि की रूपरेखा तैयार करती है।

मैनुअल धब्बा-और-डुबकी एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की ठंड

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

यहां वर्णित मैनुअल प्लंजिंग विधि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार करने के लिए एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय विधि है। इस वीडियो में, हम प्रदर्शित करेंगे कि मैन्युअल प्लंजर कैसे सेट करें, क्रायोजेन तैयार करें, और मैन्युअल ब्लोटिंग और ईएम ग्रिड की डुबकी लगाएं। मैन्युअल प्लंजिंग वातावरण तैयार करें।इस प्रक्रिया को 95% से अधिक की आर्द्रता के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने वाले ठंडे कमरे में किया जाना चाहिए हम यहां दिखाई गई सामग्रियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं और जैसा कि मैनुअल ब्लोटिंग और प्लंजिंग के लिए ऑनलाइन प्रोटोकॉल में वर्णित है। क्रायोजेन देवर और मैनुअल प्लंजर तैयार करें। क्रायोजेन देवर को इकट्ठा करने के लिए, पहले नीले स्टायरोफोम देवर के तल पर प्लेटफ़ॉर्म बेस स्थापित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह फ्लैट और स्तर है।फिर एथेन पोत धारक को प्लेटफ़ॉर्म बेस के शीर्ष पर रखें और पीतल के एथेन बर्तन डालें। अंत में, कताई ग्रिड भंडारण मंच की स्थापना। इसके बाद, मैनुअल प्लंजर के आधार पर प्लंजिंग देवर का पता लगाएं।प्लंजिंग आर्म के नीचे एथेन पोत को केंद्र में रखें और प्लंजिंग डेवर को आधार पर सुरक्षित करें। मैन्युअल प्लंजिंग ऊंचाई सेट करने के लिए, पहले प्लंजिंग आर्म के आधार पर ताजा टेप संलग्न करें। अगला, प्लंजिंग आर्म और चिमटी बेस के चारों ओर टेप को सुरक्षित रूप से लपेटकर क्लैंपिंग चिमटी की एक जोड़ी को जकड़लें।सुनिश्चित करें कि चिमटी उन्हें हल्के से दोहन करके दृढ़ता से जुड़ी हुई हैं। प्लंजिंग आर्म को पकड़ो और धीरे-धीरे पैर पैडल को निराशाजनक करके पीतल के एथेन बर्तन में चिमटी को कम करें। प्लंजिंग देवर के स्थान को समायोजित करें ताकि चिमटी पीतल के एथेन बर्तन के बीच में पता लगाएं।चिमटी की युक्तियों को चिमटी और मैनुअल प्लंजर को नुकसान से बचने के लिए पीतल के एथेन पोत के आकार या नीचे से संपर्क नहीं करना चाहिए। एक बार स्थिति सेट होने के बाद, मैन्युअल प्लंजिंग आर्म को रीसेट करें। क्रायोजेन तैयार करें।क्रायोजेन की तैयारी एक अच्छी तरह से हवादार कमरे में की जानी चाहिए और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण हर समय पहने जाने चाहिए। शुरू करने के लिए, खराब तरल नाइट्रोजन सीधे डुबकी देवार में, जब तरल नाइट्रोजन का स्तर पीतल के इथेन पोत के शीर्ष तक पहुंचता है तो बंद हो जाता है। तरल नाइट्रोजन हिंसक रूप से बुदबुदाने के बाद सिस्टम को आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त ठंडा होना चाहिए।इसमें लगभग पांच मिनट लगेंगे। एथेन एक संपीड़ित गैस के रूप में आता है और इसे संघनित करने की आवश्यकता होती है। इष्टतम इथेन संघनन के लिए गैस प्रवाह को सेट करने के लिए, ईथेन गैस लाइन की नोक को पानी के 250 मिल बीकर में डालें और बुदबुदाते हुए का निरीक्षण करें।गैस प्रवाह को बुलबुले की एक स्थिर धारा का उत्पादन करना चाहिए जो पानी की सतह को हिंसक रूप से बाधित नहीं करता है। एथेन को संघनित करना शुरू करने के लिए, पीतल के एथेन बर्तन के नीचे एथेन गैस लाइन की नोक रखें। धीरे-धीरे धातु की नोक को हिलाएं और इथेन को तरल बनाना शुरू करें।जैसे ही एथेन ठंडा होना शुरू होता है, यह एक श्रव्य शोर करेगा। पीतल के एथेन के बर्तन को तरल ईथेन से भरे तीन चौथाई तक भरें। तरल नाइट्रोजन के साथ डुबकी देवार से ऊपर, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह पीतल के एथेन पोत को छूता है लेकिन इसमें फैलता नहीं है।तरल नाइट्रोजन के अलावा एक समान इथेन ठंड के लिए आवश्यक है। नीले प्लंजिंग देवर पर फोम ढक्कन रखें, और एथेन को पूरी तरह से ठोस करने की अनुमति दें। इथेन गैस प्रवाह को पुनरारंभ करें और गैस लाइन की नोक को सावधानीपूर्वक ठोस ईथेन में रखें।टिप को पोत में लंबवत रूप से रखना और नीचे एथेन को वितरित करना महत्वपूर्ण है। धीरे-धीरे ईथेन को पिघलाने के लिए धातु की नोक को हिलाएं और तरल इथेन के स्तर को पोत के शीर्ष तक लाएं। लगभग एक मिनट के लिए ढक्कन को बंद करें और ईथेन को पीतल के बर्तन के किनारों के चारों ओर ठोस होने की अनुमति दें जब तक कि ठोस ईथेन के दो से तीन मिलीमीटर दिखाई न दें।एथेन अब जैविक नमूनों को ठंडा करने के लिए आदर्श तापमान पर है। प्लंजिंग देवर को मैन्युअल प्लंजर के आधार पर ध्यान से संलग्न करें। सुरक्षित रूप से प्लंजिंग बांह और चिमटी आधार के चारों ओर टेप लपेटकर क्लैंपिंग चिमटी की एक जोड़ी को जकड़लें।प्लंजिंग आर्म को पकड़ो और धीरे-धीरे पैर पेडल को निराशाजनक करके तरल एथेन में चिमटी को कम करें। प्लंजिंग देवर के स्थान को समायोजित करें ताकि चिमटी तरल एथेन के बीच में पता लगाए, ठोस इथेन रिंग के साथ संपर्क से बचें। प्लंजिंग सामग्री और सहायक उपकरण तैयार करें।लगभग एक सेंटीमीटर चौड़ी स्ट्रिप्स में प्रत्येक परिपत्र फिल्टर पेपर को काटकर ब्लोटिंग पेपर तैयार करें। ब्लोटिंग पेपर के केंद्र को छूने से बचें और छोटे अंत के टुकड़ों को छोड़ दें। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि ब्लॉटिंग पेपर स्ट्रिप्स सूखी, साफ और दूषित पदार्थों से मुक्त हैं।डुबकी लगाने से पहले, ग्रिड बक्से को उचित स्लॉट में डुबकी लगाने वाले देवर में रखें। सुनिश्चित करें कि ग्रिड हमारे मुक्त को घुमाने के लिए कवर करता है। डुबकी ठंड द्वारा क्रायोईएम नमूने तैयार करें।ग्रिड और ग्रिड की तैयारी की विविधता के कारण, ग्रिड हाइड्रोफिलिक प्रदान करने के लिए अनुशंसित प्रोटोकॉल का पालन करें। ग्रिड को ठीक से संभालने के लिए, बाहरी अंगूठी पर हाइड्रोफिलिक ग्रिड लेने के लिए साफ, सूखी क्लैंपिंग चिमटी का उपयोग करें। ग्रिड को सुरक्षित करने के लिए प्लास्टिक क्लैंप को स्लाइड करें और यह सुनिश्चित करने के लिए चिमटी को धीरे से टैप करें कि ग्रिड ठीक से क्लैंप किया गया है।क्लैंपिंग चिमटी में आयोजित ग्रिड के सामने नमूने के तीन माइक्रोलीटर लागू करें। चिमटी को चिमटी आधार के चारों ओर टेप लपेटकर मैन्युअल प्लंजिंग आर्म पर मजबूती से संलग्न करें। नमूना अब धब्बा और जमे हुए डुबकी के लिए तैयार है।अपनी तर्जनी उंगलियों और अंगूठे के बीच ब्लोटिंग पेपर की एक साफ पट्टी के प्रत्येक छोर को पकड़ो। एक स्थिर स्थिति स्थापित करने के लिए डुबकी देवार के किनारे पर अपने हाथों को आराम दें। ब्लोटिंग पेपर ग्रिड की सतह से लगभग एक सेंटीमीटर होना चाहिए।ब्लोटिंग पेपर को तब तक मोड़ें जब तक कि केंद्र ग्रिड से संपर्क न करे। यह महत्वपूर्ण है कि ब्लोटिंग पेपर ग्रिड सतह के समानांतर है ताकि संपर्क के लिए भी अनुमति दी जा सके और ग्रिड क्षति को रोका जा सके। जब मोबाइल तरल सामने फैलना बंद हो जाता है, तो गिनती शुरू करें।पांच सेकंड के लिए ग्रिड धब्बा. अपनी उंगलियों को अलग करें, ब्लोटिंग पेपर को दबाएं और इसे ग्रिड की सतह से तेजी से हटा दें। साथ ही, मैन्युअल प्लंजिंग आर्म को जारी करने के लिए पैर पैडल दबाएं, ग्रिड को तरल इथेन में रखने वाले चिमटी को डुबोएं।तरल इथेन में ताजा जमे हुए ग्रिड को रखते हुए, मैन्युअल प्लंजिंग आर्म से चिमटी को सावधानीपूर्वक अलग करें। ध्यान से अन-क्लैंप चिमटी तो ग्रिड हटाने योग्य है. ईथेन से तरल नाइट्रोजन के लिए एक तेज गति के साथ पीतल के एथेन पोत के नीचे तरल नाइट्रोजन जलाशय में ग्रिड को स्थानांतरित करें।ग्रिड को ग्रिड बॉक्स में रखें. प्रतिनिधि परिणाम. इस वीडियो से, शोधकर्ताओं को क्रायोईएम ग्रिड तैयार करने में सक्षम होना चाहिए, जैसे कि यह, उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए विट्रियस बर्फ की पतली फिल्मों वाले कई वर्गों के साथ।नमूना एकाग्रता और ब्लोटिंग समय कण घनत्व का अनुकूलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। यहां, हम धब्बा और डुबकी विधि का उपयोग करके क्रायोईएम नमूनों को फ्रीज करने के लिए पूर्ण वर्कफ़्लो प्रदर्शित करेंगे। एक ताजा ग्रिड लेने और जगह में ग्रिड को सुरक्षित करने के लिए एक साफ clamping चिमटी का उपयोग करें।ग्रिड के हाइड्रोफिलिक पक्ष के लिए नमूने के तीन माइक्रोलीटर लागू करें और चिमटी हैंडल के चारों ओर टेप लपेटकर मैन्युअल प्लंजिंग बांह के लिए सुरक्षित चिमटी। ग्रिड की सतह के समानांतर ब्लोटिंग पेपर की स्थिति और ब्लोटिंग शुरू करने के लिए धीरे से ब्लोटिंग पेपर को ग्रिड की ओर मोड़ें। समय की वांछित राशि के बाद, एक snapping गति में blotting कागज ले जाएँ ग्रिड की सतह से दूर जबकि पैर पेडल depressing डुबकी हाथ जारी करने के लिए, तरल इथेन में ग्रिड डुबकी.चिमटी और मैनुअल प्लंजिंग आर्म के आसपास से टेप को सावधानीपूर्वक खोलना। एक तेज गति के साथ, जल्दी से तरल नाइट्रोजन जलाशय में इथेन पोत से ग्रिड को स्थानांतरित करें। ग्रिड भंडारण बॉक्स में ग्रिड रखें और चिमटी को सूखने के लिए किम वाइप में लपेटें; दोहराएँ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कंकाल मांसपेशी तंतुओं में उपकोशिकीय ग्लाइकोजन वितरण का परिमाणीकरण

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...