Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Ringraziamo i membri del laboratorio Herzik per aver pensato criticamente e per aver fornito feedback su questo manoscritto e sul contenuto del video. M.A.H.Jr. è supportato da NIH R35 GM138206 e come Searle Scholar. H.P.M.N è supportato dal Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vorremmo anche ringraziare Bill Anderson, Charles Bowman e il Dr. Gabriel Lander dello Scripps Research Institute per l'aiuto nella progettazione, assemblaggio e test dello stantuffo manuale mostrato nel video.

1. Preparare l'ambiente di immersione manuale
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 5-30 minuti
<ol><li>Posizionare lo stantuffo manuale in una cella frigorifera a 4 °C dove un umidificatore può essere co-posizionato per mantenere la stanza vicino al 100% di umidità relativa (RH) (Figura 1A). ATTENZIONE: Si prega di consultare le linee guida dell'istituzione in materia di salute e sicurezza ambientale per la posizione sicura dello stantuffo manuale e le op...

La vitrificazione di campioni biologici per l'imaging mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) rimane un passo di fondamentale importanza per il successo della determinazione della struttura. Il metodo manuale blot-and-plunge descritto in questo protocollo rappresenta un metodo economico, affidabile e robusto per congelare rapidamente campioni biologici in film sottili di ghiaccio vitreo per l'imaging crioEM. Utilizzando i metodi descritti nel manoscritto, i ricercatori saranno in grado d...

La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) è una potente tecnica strutturale che può essere utilizzata per risolvere strutture di campioni biologici dinamici a risoluzione quasi atomica1,2,3,4. In effetti, i recenti progressi nelle tecnologie dei rivelatori di elettroni diretti4,5,6,7,8,9,10, i miglioramenti nelle sorgenti di elettroni4,11,12,13,14 e la stabilità delle lenti elettromagnetiche15, insieme al continuo sviluppo dell'acquisizione dei dati 16,17 e pacchetti software di analisi18,19, hanno permesso ai ricercatori di determinare ora di routine strutture di campioni ben educati con risoluzione 3 Å o superiore4,11,13,14,20,21,22,23 . Nonostante queste migliorate capacità di imaging ed elaborazione dei dati, la preparazione della griglia crioEM rimane il principale ostacolo per una determinazione efficace della struttura ad alta risoluzione e spesso funge da collo di bottiglia considerevole nel flusso di lavoro EM24,25,26,27.
CryoEM si basa sull'imaging di campioni biologici in soluzioni acquose che vengono congelate per formare un sottile film di ghiaccio "simile al vetro" - un processo noto come vetrificazione - che preserva lo stato biochimico nativo. La vitrificazione di campioni biologici per crioEM risale a oltre 40 anni28,29,30 e molte tecniche e attrezzature che sono state sviluppate per questo processo si basano sul metodo blot-and-plunge originariamente dettagliato31,32,33,34,35 , per cui un piccolo volume di campione (ad esempio, 1-5 μL) viene applicato a una griglia EM specializzata prima che la soluzione in eccesso venga rimossa utilizzando l'interazione fisica della griglia con la carta assorbente. La tempistica di questo processo è solitamente determinata empiricamente per ciascun campione poiché un componente critico dei campioni di congelamento è lo spessore del film di ghiaccio vitreo - se il ghiaccio è troppo spesso, la qualità dell'immagine si deteriora drammaticamente a causa dell'aumento della dispersione del fascio di elettroni mentre il ghiaccio troppo sottile può limitare gli orientamenti proteici e / o escludere particelle dal centro dei fori della lamina della griglia36 . Questa dipendenza dallo spessore di ghiaccio perfetto per il crioEM a singola particella ha portato a una vasta gamma di tecniche e apparecchiature in grado di congelare i campioni, tra cui robotica37,38, microfluidica42 e dispositivi ad ultrasuoni o a spruzzo27,39,40,41,42,43,44 . Negli ultimi anni, alcuni dei più diffusi dispositivi di preparazione dei campioni si affidano all'uso della robotica per il congelamento automatizzato dei campioni utilizzando la tecnica blot-and-plunge45. Mentre questi dispositivi sono progettati per creare in modo riproducibile uno spessore di ghiaccio adeguato per l'imaging, spesso rimangono troppo costosi per i singoli laboratori da acquistare e gestire e si trovano generalmente all'interno di strutture crioEM a tariffe orarie per l'uso. Negli ultimi anni, l'originale tecnica manuale blot-and-plunge è tornata in uso3,47,48,49,50,51,52. In effetti, un dispositivo blot-and-plunge azionato manualmente può ottenere griglie crioEM di alta qualità a una frazione del costo delle controparti robotiche. Inoltre, il blotting manuale offre anche un maggiore controllo degli utenti sul blotting in quanto i ricercatori possono regolare il tipo di blotting (ad esempio, back-blotting della griglia, front-blotting della griglia, ecc.) e il tempo di blotting in base a ogni singolo campione e domande di ricerca.
In questo articolo, forniamo dettagli su come congelare efficacemente i campioni biologici utilizzando un tradizionale dispositivo di vetrificazione manuale blot-and-plunge abbinato a una piattaforma dewar progettata su misura53. Vengono fornite le migliori pratiche, tra cui la preparazione del criogeno, la gestione della griglia, l'applicazione del campione e il blotting, nonché le insidie comuni e le raccomandazioni su come superare questi ostacoli. Vengono discussi consigli su come aumentare la riproducibilità dello spessore del ghiaccio tra i preparati a griglia e su come modificare il blotting del campione in base al tipo di campione biologico. Dato il basso costo associato all'acquisto e al funzionamento dello stantuffo manuale descritto in questo manoscritto, i laboratori di tutto il mondo possono preparare campioni biologici per il crioEM in modo economico e riproducibile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

L'imaging di campioni biologici con elettroni per la determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) richiede un sottile strato di ghiaccio vitreo contenente le biomolecole di interesse. Nonostante i numerosi progressi tecnologici degli ultimi anni che hanno spinto il crioEM a singola particella in prima linea nella biologia strutturale, i metodi con cui i campioni vengono vetrificati per l'imaging ad alta risoluzione spesso rimangono il passo limitante della velocità. Sebbene numerosi sforzi recenti abbiano fornito i mezzi per superare gli ostacoli frequentemente incontrati durante la vetrificazione dei campioni, tra cui lo sviluppo di nuovi supporti per campioni e un'innovativa strumentazione di vitrificazione, il tradizionale stantuffo ad azionamento manuale rimane un punto fermo nella comunità crioEM a causa del basso costo di acquisto e della facilità d'uso. Qui, forniamo metodi dettagliati per l'utilizzo di un dispositivo blot-and-plunge standard a ghigliottina azionato manualmente per la vitrificazione di campioni biologici per l'imaging ad alta risoluzione mediante crioEM a singola particella. Inoltre, vengono descritti anche i problemi comunemente riscontrati e le raccomandazioni per la risoluzione dei problemi per quando una preparazione standard non riesce a produrre un campione adatto.

L'esecuzione riuscita del protocollo blot-and-plunge qui descritto si tradurrà in uno strato sottile e uniforme di ghiaccio vitreo privo di ghiaccio esagonale, contaminanti e grandi gradienti di ghiaccio inutilizzabile che possono essere osservati al microscopio elettronico (Figura 3). Il contatto incoerente della carta assorbente con la superficie della griglia, la rimozione prematura della carta assorbente o lo spostamento della carta assorbente durante il contatto con la griglia possono ...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Questo manoscritto delinea il metodo blot-and-plunge per congelare manualmente i campioni biologici per la microscopia elettronica criogenica a singola particella.

Congelamento manuale blot-and-plunge di campioni biologici per microscopia elettronica criogenica a particella singola

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Il metodo di immersione manuale qui descritto è un metodo economico e affidabile per la preparazione di campioni per la microscopia elettronica a trasmissione. In questo video, dimostreremo come impostare lo stantuffo manuale, preparare il criogeno ed eseguire il blotting manuale e l'immersione delle griglie EM. Preparare l'ambiente di immersione manuale.Questa procedura deve essere eseguita in una cella frigorifera mantenuta a 40 gradi Celsius con umidità superiore al 95% Si consiglia di utilizzare i materiali mostrati qui e come descritto nel protocollo online per il blotting e l'immersione manuale. Preparare il criogeno Dewar e lo stantuffo manuale. Per assemblare il criogeno Dewar, installare prima la base della piattaforma nella parte inferiore del polistirolo blu Dewar, assicurandosi che sia piatta e piana.Quindi posizionare il portaborsella di etano sopra la base della piattaforma e inserire il recipiente di etano di ottone. Infine, situare la piattaforma di stoccaggio della griglia rotante. Quindi, posizionare il Dewar che si immerge alla base dello stantuffo manuale.Centra la nave di etano sotto il braccio di immersione e fissa il Dewar che si immerge alla base. Per impostare l'altezza di immersione manuale, attaccare prima del nastro adesivo fresco alla base del braccio di immersione. Quindi, fissare un paio di pinzette di serraggio avvolgendo saldamente il nastro attorno al braccio di immersione e alla base della pinzetta.Assicurarsi che le pinzette siano saldamente attaccate toccandole leggermente. Tenere il braccio che si immerge e abbassare lentamente le pinzette nel vaso di etano di ottone premendo il pedale. Regola la posizione del Dewar in picchiata in modo che le pinzette si trovino al centro del vaso di etano di ottone.Le punte delle pinzette non devono contattare le dimensioni o il fondo del recipiente di etano in ottone per evitare danni alle pinzette e allo stantuffo manuale. Una volta impostata la posizione, reimpostare il braccio di immersione manuale. Preparare il criogeno.La preparazione criogena deve essere eseguita in una stanza ben ventilata e devono essere indossati sempre adeguati dispositivi di protezione individuale. Per cominciare, scarso azoto liquido direttamente nel Dewar in picchiata, fermandosi quando il livello di azoto liquido raggiunge la parte superiore del vaso di etano di ottone. Il sistema dovrebbe essere abbastanza freddo da procedere dopo che l'azoto liquido smette di gorgogliare violentemente.Ci vorranno circa cinque minuti. L'etano si presenta come gas compresso e deve essere condensato. Per impostare il flusso di gas per una condensazione ottimale dell'etano, inserire la punta della linea del gas di etano in un becher d'acqua da 250 mil e osservare il gorgogliamento.Il flusso di gas dovrebbe produrre un flusso costante di bolle che non interrompa violentemente la superficie dell'acqua. Per iniziare a condensare l'etano, posizionare la punta della linea del gas di etano sul fondo del recipiente di etano di ottone. Mescolare lentamente la punta di metallo e iniziare a liquefare l'etano.Non appena l'etano inizia a raffreddarsi, emetterà un rumore udibile. Riempire il recipiente di etano di ottone a tre quarti pieno di etano liquido. Completare il Dewar con azoto liquido, assicurandosi che tocchi il vaso di etano in ottone ma non si riversi in esso.L'aggiunta di azoto liquido è necessaria per il congelamento uniforme dell'etano. Posizionare il coperchio di schiuma sul Dewar blu e lasciare che l'etano si solidifichi completamente. Riavviare il flusso di gas etano e posizionare con attenzione la punta della linea del gas nell'etano solido.È importante posizionare la punta verticalmente nella nave e dispensare etano sul fondo. Mescolare lentamente la punta metallica per sciogliere l'etano e portare il livello di etano liquido fino alla parte superiore della nave. Chiudere il coperchio per circa un minuto e lasciare che l'etano si solidifichi attorno ai bordi del recipiente di ottone fino a quando non sono visibili due o tre millimetri di etano solido.L'etano è ora ad una temperatura ideale per il congelamento di campioni biologici. Attaccare con attenzione il Dewar a immersione alla base dello stantuffo manuale. Fissare un paio di pinzette di serraggio avvolgendo saldamente il nastro attorno al braccio di immersione e alla base della pinzetta.Tenere il braccio che si immerge e abbassare lentamente le pinzette nell'etano liquido premendo il pedale. Regolare la posizione del Dewar in immersione in modo che le pinzette si trovino al centro dell'etano liquido, evitando il contatto con l'anello di etano solido. Preparare materiali e accessori per immersioni.Preparare la carta assorbente tagliando ogni carta da filtro circolare in strisce larghe circa un centimetro. Evitare di toccare il centro della carta assorbente e scartare i pezzi finali più piccoli. È importante assicurarsi che le strisce di carta assorbente siano asciutte, pulite e prive di contaminanti.Prima di immergersi, posiziona le scatole della griglia nel Dewar che immerge nelle fessure appropriate. Assicurati che la griglia copra il nostro libero di ruotare. Prepara i campioni di CryoEM con Plunge Freezing.A causa della diversità dei preparativi della griglia e della griglia, seguire i protocolli raccomandati per rendere le griglie idrofile. Per gestire correttamente le griglie, utilizzare pinzette di serraggio pulite e asciutte per raccogliere le griglie idrofile sull'anello esterno. Far scorrere il morsetto di plastica per fissare la griglia e picchiettare delicatamente le pinzette per assicurarsi che la griglia sia bloccata correttamente.Applicare tre microlitri di campione sulla parte anteriore della griglia tenuta nelle pinzette di serraggio. Fissare saldamente le pinzette al braccio di immersione manuale avvolgendo il nastro attorno alla base della pinzetta. Il campione è ora pronto per essere cancellato e immerso congelato.Tieni ogni estremità di una striscia pulita di carta assorbente tra l'indice e il pollice. Appoggia le mani sul bordo del Dewar che si immerge per stabilire una posizione stabile. La carta assorbente dovrebbe trovarsi a circa un centimetro dalla superficie della griglia.Piegare la carta assorbente fino a quando il centro non contatta la griglia. È importante che la carta assorbente sia parallela alla superficie della griglia per consentire un contatto uniforme e prevenire danni alla griglia. Quando il frontale liquido mobile smette di diffondersi, inizia a contare.Cancella la griglia per cinque secondi. Schiocca le dita, sforzando la carta assorbente e rimuovendola rapidamente dalla superficie della griglia. Contemporaneamente, premere il pedale per rilasciare il braccio di immersione manuale, immergendo le pinzette che tengono la griglia nell'etano liquido.Mantenendo la griglia appena congelata nell'etano liquido, staccare con cura le pinzette dal braccio di immersione manuale. Scollegare con cura le pinzette in modo che la griglia sia rimovibile. Spostare la griglia nel serbatoio di azoto liquido sotto il recipiente di etano di ottone con un rapido movimento dall'etano all'azoto liquido.Posizionare la griglia nella casella della griglia. Risultati rappresentativi. Da questo video, i ricercatori dovrebbero essere in grado di preparare griglie CryoEM, come questa, con molti quadrati contenenti sottili film di ghiaccio vitreo per l'imaging ad alta risoluzione.La concentrazione del campione e il tempo di blotting possono essere regolati per ottimizzare la densità delle particelle. Qui, dimostreremo l'intero flusso di lavoro per il congelamento dei campioni CryoEM utilizzando il metodo blot and plunge. Utilizzare una pinzetta di serraggio pulita per raccogliere una nuova griglia e fissare la griglia in posizione.Applicare tre microlitri di campione sul lato idrofilo della griglia e fissare una pinzetta al braccio di immersione manuale avvolgendo il nastro attorno alla maniglia della pinzetta. Posizionate la carta assorbente parallelamente alla superficie della griglia e piegate delicatamente la carta assorbente verso la griglia per avviare il blotting. Dopo il periodo di tempo desiderato, spostare la carta assorbente con un movimento di scatto lontano dalla superficie della griglia mentre si preme il pedale per rilasciare il braccio che si immerge, immergendo la griglia nell'etano liquido.Srotolare con cura il nastro da intorno alle pinzette e al braccio di immersione manuale. Con un movimento rapido, trasferire rapidamente la griglia dal serbatoio di etano al serbatoio di azoto liquido. Posizionare la griglia nella scatola di stoccaggio della griglia e avvolgere le pinzette in un Kim Wipe per asciugare; ripetere.

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