Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

私たちは、この原稿とビデオコンテンツについて批判的に考え、フィードバックを提供してくれたHerzikラボのメンバーに感謝します。M.A.H.Jr.はNIH R35 GM138206およびサール学者によってサポートされています。H.P.M.Nは分子生物物理学トレーニンググラント(NIH T32 GM008326)によってサポートされています。また、スクリプス研究所のビル・アンダーソン、チャールズ・ボウマン、ガブリエル・ランダー博士に感謝し、ビデオに示されている手動プランジャーの設計、組み立て、テストを支援したいと思います。

1. 手動の突っ込み環境を準備する
注意:予想運転時間:5~30分
<ol><li>加湿器を同じ場所に設置できる4°Cの冷たい部屋で手動プランジャーを探して、相対湿度(RH)の100%近くを維持します(図1A)。 注意:手動プランジャーと推奨操作の安全な場所については、施設の環境安全衛生ガイドラインに従ってください。</li>
	<li>グリッドの準備の前に、冷たい部?...

単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)によるイメージングのための生物学的標本のガラス化は、構造決定を成功させるための極めて重要なステップであり続ける。このプロトコルで説明されている手動のブロットとプランジ法は、クライオEMイメージング用の氷の薄膜中の生物学的サンプルを迅速に凍結するための費用対効果の高い、信頼性の高い、堅牢な方法を表します。原稿に記載されている方...

単粒子低温電子顕微鏡(クライオエム)は、動的生物学的標本の構造を原子に近い分解能1,2,3,4に解決するために使用できる強力な構造技術です。実際、最近の直接電子検出器技術の進歩 4,5,6,7,8,9,10, 電子源の改善 4,11,12,13,14,電磁気レンズ安定性15と相まってデータ取得の継続的な発展16,17および分析ソフトウェアパッケージ18,19は、研究者が3 Å解像度またはより良い3Åに行き届いた標本の構造を日常的に決定することを可能にしました4,11,11,13,14,20,21,22,23.これらの改善された画像およびデータ処理機能にもかかわらず、cryoEMグリッドの準備は、高解像構造の決定を成功させるための最大の障害であり、しばしばEMワークフロー24、25、26、27においてかなりのボトルネックとなる。
CryoEMは、天然の生化学的状態を維持する「ガラス状」氷(ガラス化と呼ばれるプロセス)の薄膜を形成するために凍結された水溶液中の生物学的サンプルのイメージングに依存しています。クライオEM用の生物学的サンプルのガラス化は40年以上前までさかのぼり、このプロセスのために開発された多くの技術や機器は、当初の詳細なブロットとプランジ法に依存しています31,32,33,34,35 これは、過剰な溶液がブロッティング紙とのグリッドの物理的相互作用を使用して除去される前に、少量のサンプル(例えば、1〜5 μL)が特殊なEMグリッドに適用される。このプロセスのタイミングは、通常、氷のサンプルの重要な成分が膜膜の厚さであるように各標本について経験的に決定されます - 氷が厚すぎると、薄すぎる氷がタンパク質の配向を制限したり、グリッド箔の中心から粒子を除外することができますが、電子ビームの散乱の増加によりイメージング品質が劇的に悪化します36.単粒子クライオEMのための完璧な氷の厚さにこの依存は、ロボティクス37,38、マイクロ流体42、超音波または噴霧装置27,39,40,41,42,43,44を含むサンプルを凍結できる幅広い技術と機器につながっています。.近年、最も人気のあるサンプル調製装置のいくつかは、ブロットとプランジ技術45を使用してサンプルの自動凍結のためのロボット工学の使用に依存しています。これらのデバイスは、イメージング用の適切な氷の厚さを再現的に作成するように設計されていますが、個々のラボが購入して動作するには高価すぎることが多く、一般的にcryoEM施設内で使用のために毎時の料金で見られます。近年、オリジナルのマニュアルブロットアンドプランジ技術は、使用数が増加し、3,47,48,49,50,51,52に戻ってきました。実際、手動で操作されたブロットとプランジデバイスは、ロボットの対応するコストのほんの一部で高品質のクライオEMグリッドを実現できます。さらに、手動ブロッティングは、研究者がブロッティングの種類(すなわち、グリッドのバックブロット、グリッドのフロントブロッティングなど)、および個々のサンプルと研究の質問に基づいてブロット時間を調整できるため、より多くのユーザーがブロッティングを制御することができます。
本稿では、従来の手動ブロットとプランジガラス化装置を使用して、カスタム設計のデュワープラットフォーム53と組み合わせて生物学的サンプルを効果的に凍結する方法について詳しく説明します。クライオゲンの準備、グリッド処理、サンプルアプリケーション、ブロッティングなどのベストプラクティス、これらのハードルを克服する方法に関する一般的な落とし穴と推奨事項が提供されています。グリッド調製の間の氷の厚さを向上させる方法と、生物学的標本の種類に基づいてサンプルブロッティングを変更する方法についてのアドバイスが議論されています。この原稿に記載されている手動プランジャーの購入と操作に関連する低コストを考えると、世界中のラボは、コスト効率が良く再現可能な方法でcryoEMの生物学的標本を調製することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)による高解像構造決定のための電子を用いた生物学的標本のイメージングには、目的の生体分子を含む亜粒子の薄層が必要です。近年、単粒子cryoEMを構造生物学の最前線に押し上げた多くの技術進歩にもかかわらず、高解像イメージングのために標本をガラス化する方法は、しばしばレート制限ステップのままです。新しいサンプルサポートや革新的なガラス化計器の開発など、標本ガラス化中に頻繁に遭遇するハードルを克服するための多くの最近の努力が提供されていますが、従来の手動操作プランジャーは、購入コストが低く、操作が容易であるため、cryoEMコミュニティの定番のままです。ここでは、単粒子クライオEMによる高解像度イメージングのための生物学的標本のガラス化のための標準のギロチンスタイルの手動操作ブロットとプランジデバイスを使用するための詳細な方法を提供します。また、標準的な準備が適切な標本を得られなかった場合に関する一般的な問題とトラブルシューティングの推奨事項も説明します。

ここで説明するブロット・アンド・プランジプロトコルの実行に成功すると、電子顕微鏡下で観察できる六角形の氷、汚染物質、および使用できない氷の大きな勾配のない薄く均一な層のビトレウス氷が生じる(図3)。ブロッティング紙とグリッド表面との接触が一貫していない、ブロッティング紙を早期に取り外す、またはグリッド接触中にブロッティング紙を動かす?...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

この原稿は、単粒子低温電子顕微鏡用の生物学的標本を手動で凍結するブロット・アンド・プランジ法の概要を説明している。

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

ここで説明する手動突っ込み方法は、透過電子顕微鏡用サンプルを調製するための費用対効果の高い、信頼性の高い方法です。このビデオでは、手動プランジャーを設定し、クライオゲンを準備し、EMグリッドの手動ブロッティングと突っ込みを行う方法を紹介します。手動の突っ込み環境を準備します。この手順は、湿度が95%を超える摂氏40度に維持された冷たい部屋で行う必要があり、手動ブロッティングと突っ込みのためのオンラインプロトコルに記載されているように、ここに示されている材料を使用することをお勧めします。クライオゲンデュワーとマニュアルプランジャーを準備します。クライオゲンデュワーを組み立てるには、まず、それが平らでレベルであることを確認し、青い発泡スチロールデュワーの下部にプラットフォームベースをインストールします。次に、エタン容器ホルダーをプラットフォームベースの上に置き、真鍮エタン容器を挿入します。最後に、回転グリッドストレージプラットフォームを配置します。次に、マニュアルプランジャーのベースに突っ込んだデュワーを見つけます。突っ込んだ腕の下にエタン船を中心に、突っ込んだデュワーをベースに固定します。手動の突っ込み高さを設定するには、最初に突っ込んだ腕のベースに新鮮なテープを取り付けます。次に、突っ込んだ腕とピンセットベースにテープをしっかりと巻き付けて、ピンセットを締めます。ピンセットを軽くタップしてしっかりと取り付けられるようにします。突っ込んだ腕を持ち、足のペダルを落としてピンセットを真鍮のエタン容器にゆっくりと下ろします。ピンセットが真鍮エタン容器の真ん中に位置するように、突っ込むデュワーの位置を調整します。ピンセットの先端は、ピンセットおよび手動プランジャーへの損傷を避けるために、真鍮エタン容器のサイズまたは底部に接触してはならない。位置を設定したら、手動の突っ込みアームをリセットします。クライオゲンを準備します。クライオゲンの準備は換気の良い部屋で行われるべきであり、適切な個人的な保護具は常に着用する必要があります。まず、液体窒素が急落したデュワーに直接入り、液体窒素レベルが真鍮エタン容器の上部に達すると停止します。液体窒素が激しく泡立つのを止めた後に進むのに十分な寒さでなければなりません。これには約5分かかります。エタンは圧縮ガスとして来て、凝縮する必要があります。最適なエタン凝縮のためにガスの流れを設定するには、エタンガスラインの先端を250ミルビーカーの水に挿入し、泡立ちを観察します。ガスの流れは、激しく水面を破壊しない気泡の安定した流れを生成する必要があります。エタンの凝縮を開始するには、真鍮エタン容器の底部にエタンガスラインの先端を置きます。金属チップをゆっくりとかき混ぜ、エタンの液化を開始します。エタンが冷え始めるとすぐに、それは聞こえる音を出すでしょう。真鍮のエタン容器を液体エタンでいっぱいの4分の3に満たします。液体窒素で急落したデュワーを上にして、真鍮のエタン容器に触れますが、それにこぼれないようにします。均一なエタン凍結には液体窒素の添加が必要である。青い突っ込みデュワーに泡のふたを置き、エタンが完全に固まるようにします。エタンガスの流れを再開し、気体ラインの先端を固体エタンに慎重に入れます。先端を容器の中に縦に置き、底部にエタンを分配することが重要です。金属チップをゆっくりとかき混ぜてエタンを溶かし、液体エタンのレベルを容器の上部に持ち上げます。蓋を約1分間閉じ、2~3ミリメートルの固体エタンが見えるまで、真鍮容器の縁の周りにエタンを固めます。エタンは現在、生物学的サンプルを凍結するのに理想的な温度に達しています。突っ込んだデュワーを手動プランジャーのベースに注意深く取り付けます。突っ込んだ腕とピンセットベースにテープをしっかりと巻き付けて、ピンセットを締めます。突っ込んだ腕を持ち、足のペダルを落としてゆっくりとピンセットを液体エタンに下げます。ピンセットが液体エタンの真ん中に位置し、固体エタンリングとの接触を避けるように、突っ込んだデュワーの位置を調整します。突っ込み素材とアクセサリーを準備します。各円形のフィルターペーパーを約1センチメートル幅のストリップに切って、ブロッティング紙を準備します。ブロッティング紙の中心に触れないようにし、小さな端部を捨てます。ブロッティング紙のストリップが乾燥し、清潔で、汚染物質がないことを確認することが重要です。突っ込む前に、グリッドボックスを突っ込んだデュワーに適切なスロットに入れます。グリッドが自由に回転できるようにしてください。プランジ凍結によりクライオエム標本を準備する。グリッドとグリッドの準備の多様性のために、親水性グリッドをレンダリングするための推奨プロトコルに従ってください。グリッドを適切に処理するには、クリーンで乾燥したクランプピンセットを使用して、外輪の親水性グリッドを拾います。プラスチック製クランプをスライドさせてグリッドを固定し、ピンセットを軽くタップしてグリッドが適切にクランプされていることを確認します。クランプピンセットに保持されているグリッドの前面にサンプルの3マイクロリットルを適用します。ピンセットベースにテープを巻いて手動突っ込みアームにピンセットをしっかりと取り付けます。サンプルは、今すぐ消え、凍結急落する準備が整いました。人差し指と親指の間にきれいな紙の端を持ちます。安定した位置を確立するために、急激なデュワーの端に手を置きます。ブロッティング紙は、グリッドの表面から約1センチメートルでなければなりません。中央がグリッドに接触するまで、ブロッティングペーパーを曲げます。ブロッティング紙は、均一な接触を可能にし、グリッドの損傷を防ぐために、グリッド面に平行にすることが重要です。移動式液体フロントが広がらなくなったら、カウントを開始します。グリッドを5秒間ブロットします。指を離して、吸引紙を緊張させ、グリッドの表面から素早く取り除きます。同時に、フットペダルを押して手動突っ込みアームを解放し、グリッドを保持するピンセットを液体エタンに突っ込みます。液体エタンに新鮮な凍結グリッドを維持し、慎重に手動突っ込みアームからピンセットを取り外します。グリッドが取り外し可能になるようにピンセットを慎重に取り外します。エタンから液体窒素への素早い動きで、真鍮エタン容器の下の液体窒素貯蔵所にグリッドを移動します。グリッド ボックスにグリッドを配置します。代表結果。このビデオから、研究者は、高解像度イメージングのための亜真の氷の薄膜を含む多くの正方形で、このようなCryoEMグリッドを準備することができるはずです。サンプル濃度とブロッティング時間を調整して、粒子密度を最適化することができます。ここでは、ブロットとプランジ法を使用してCryoEMサンプルを凍結するための完全なワークフローを示します。きれいなクランプ用のトゥイザーを使用して、新鮮なグリッドを拾い、グリッドを所定の位置に固定します。グリッドの親水性側に3マイクロリットルのサンプルを塗布し、ピンセットハンドルにテープを巻いて手動突っ込みアームにピンセットを固定します。ブロッティングペーパーをグリッド表面に平行に配置し、ブロッティング紙をグリッドに向かってそっと曲げて、ブロッティングを開始します。所望の時間の後、突っ込んだ腕を解放するために足のペダルを押しながらグリッド表面から離れてスナップモーションでブロッティング紙を移動し、液体エタンにグリッドを突っ込みます。ピンセットと手動の突っ込み腕の周りから慎重にテープを巻き戻します。1つの迅速な動きで、すぐに液体窒素貯蔵所にエタン容器からグリッドを移す。グリッドストレージボックスにグリッドを置き、ピンセットをキムワイプでラップして乾燥させます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

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Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

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Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

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The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

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