Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Agradecemos aos membros do laboratório Herzik por pensarem criticamente e fornecerem feedback sobre este manuscrito e o conteúdo do vídeo. M.A.H.Jr. é apoiado pelo NIH R35 GM138206 e como um Estudioso searle. H.P.M.N é apoiado pelo Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Também gostaríamos de agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman e Dr. Gabriel Lander no Scripps Research Institute por ajudar a projetar, montar e testar o êmbolo manual mostrado no vídeo.

1. Prepare o ambiente manual de mergulho
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 5-30 minutos
<ol><li>Localize o êmbolo manual em uma sala fria de 4 °C onde um umidificador possa ser co-localizado para manter a sala perto de 100% de umidade relativa (RH) (Figura 1A). ATENÇÃO: Consulte as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental da instituição para a localização segura do êmbolo manual e as operações recomendadas.</li>
	<li>Antes da preparação d...

A vitrificação de espécimes biológicos para imagem por microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas (crioEM) continua sendo um passo criticamente importante para a determinação bem sucedida da estrutura. O método manual de blot-and-plunge descrito neste protocolo representa um método econômico, confiável e robusto para congelar rapidamente amostras biológicas em filmes finos de gelo vítreo para imagens crioEM. Usando os métodos descritos no manuscrito, os pesquisadores poderão montar e operar ...

Microscopia criogênica de elétrons de partículas únicas (crioEM) é uma técnica estrutural poderosa que pode ser usada para resolver estruturas de espécimes biológicos dinâmicos para resolução quase atômica1,2,3,4. De fato, os recentes avanços nas tecnologias diretas de detector de elétrons4,5,6,7,8,9,10, melhorias nas fontes de elétrons4,11,12,13,14, e estabilidade de lentes eletromagnéticas15, juntamente com o desenvolvimento contínuo da aquisição de dados 16,17 e pacotes de software de análise18,19, permitiram aos pesquisadores determinar rotineiramente estruturas de espécimes bem comportados para resolução de 3 Å ou melhor 4,11,13,14,20,21,22,23 . Apesar desses recursos aprimorados de imagem e processamento de dados, a preparação da rede crioEM continua sendo o maior impedimento para uma determinação bem-sucedida da estrutura de alta resolução e muitas vezes serve como um gargalo considerável no fluxo de trabalho EM24,25,26,27.
O CrioEM baseia-se na imagem de amostras biológicas em soluções aquosas que são congeladas para formar uma fina película de gelo "semelhante a vidro" - um processo conhecido como vitrificação - que preserva o estado bioquímico nativo. A vitrificação de amostras biológicas para crioEM remonta a mais de 40 anos28,29,30 e muitas técnicas e equipamentos que foram desenvolvidos para este processo dependem do método originalmente detalhado de blot-and-plunge31,32,33,34,35 , pelo qual um pequeno volume de amostra (por exemplo, 1-5 μL) é aplicado a uma grade EM especializada antes que a solução em excesso seja removida usando interação física da grade com papel de mancha. O tempo deste processo é geralmente empiricamente determinado para cada espécime como um componente crítico das amostras de congelamento é a espessura do filme de gelo vítreo - se o gelo é muito grosso, então a qualidade da imagem se deteriora dramaticamente devido ao aumento da dispersão do feixe de elétrons, enquanto o gelo que é muito fino pode restringir orientações proteicas e/ou excluir partículas do centro dos buracos de papel alumínio da grade36 . Essa dependência da espessura perfeita do gelo para crioEM de partículas únicas levou a uma ampla gama de técnicas e equipamentos que podem congelar amostras, incluindo robótica37,38, microfluidos42 e dispositivos ultrassônicos ou pulverizadores27,39,40,41,42,43,44 . Nos últimos anos, alguns dos dispositivos de preparação de amostras mais populares dependem do uso de robótica para congelamento automatizado de amostras usando a técnica de blot-and-plunge45. Embora esses dispositivos sejam projetados para criar de forma reprodutivelmente a espessura adequada do gelo para imagens, eles muitas vezes permanecem muito caros para laboratórios individuais comprarem e operarem e são geralmente encontrados dentro de instalações crioEM a taxas horárias para uso. Nos últimos anos, a técnica original de blot-and-plunge manual voltou a ser usada em aumento3,47,48,49,50,51,52. De fato, um dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente pode alcançar grades crioEM de alta qualidade a uma fração do custo das contrapartes robóticas. Além disso, a mancha manual também oferece mais controle dos usuários sobre a mancha, pois os pesquisadores podem ajustar o tipo de mancha (ou seja, mancha traseira da grade, mancha frontal da grade, etc.), e tempo de mancha com base em cada amostra individual e questões de pesquisa.
Neste artigo, fornecemos detalhes sobre como congelar efetivamente amostras biológicas usando um dispositivo de vitrificação manual tradicional, juntamente com uma plataforma de guerra personalizada53. As melhores práticas, incluindo preparação do criogen, manuseio da grade, aplicação da amostra e manchas, bem como armadilhas e recomendações comuns sobre como superar esses obstáculos são fornecidas. São discutidos conselhos sobre como aumentar a reprodutibilidade da espessura do gelo entre as preparações da rede e como modificar a mancha de amostra com base no tipo de espécime biológico. Dado o baixo custo associado à compra e operação do êmbolo manual descrito neste manuscrito, laboratórios em todo o mundo podem preparar espécimes biológicos para crioEM de forma econômica e reprodutível.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

Imagens de amostras biológicas com elétrons para determinação de estrutura de alta resolução por microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas (crioEM) requer uma fina camada de gelo vítreo contendo as biomoléculas de interesse. Apesar de numerosos avanços tecnológicos nos últimos anos que impulsionaram o crioEM de partículas únicas à vanguarda da biologia estrutural, os métodos pelos quais os espécimes são vitrificados para imagens de alta resolução muitas vezes permanecem o passo limitante da taxa. Embora numerosos esforços recentes tenham proporcionado meios para superar obstáculos frequentemente encontrados durante a vitrificação de espécimes, incluindo o desenvolvimento de novos suportes de amostras e instrumentação inovadora de vitrificação, o tradicional êmbolo operado manualmente continua sendo um grampo na comunidade crioem devido ao baixo custo de compra e facilidade de operação. Aqui, fornecemos métodos detalhados para o uso de um dispositivo padrão, no estilo guilhotina operado manualmente para a vitrificação de amostras biológicas para imagens de alta resolução por crioEM de uma única partícula. Além disso, problemas comumente encontrados e recomendações de solução de problemas para quando uma preparação padrão não produz uma amostra adequada também são descritas.

A execução bem sucedida do protocolo de manchas e mergulho descrito aqui resultará em uma fina camada uniforme de gelo vítreo que está livre de qualquer gelo hexagonal, contaminantes e grandes gradientes de gelo inutilizável que podem ser observados sob o microscópio eletrônico (Figura 3). O contato inconsistente do papel de mancha com a superfície da grade, removendo prematuramente o papel de mancha, ou movendo o papel de mancha durante o contato com a rede pode diminuir a qualidad...

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Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Este manuscrito descreve o método de mancha e mergulho para congelar manualmente espécimes biológicos para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas.

Congelamento manual de amostras biológicas para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

O método manual de mergulho descrito aqui é um método econômico e confiável para preparar amostras para a microscopia eletrônica de transmissão. Neste vídeo, demonstraremos como configurar o êmbolo manual, preparar criogen e executar manchas manuais e mergulhos de grades EM. Prepare o ambiente manual de mergulho.Este procedimento deve ser realizado em uma sala fria mantida a 40 graus Celsius com umidade superior a 95% Recomendamos o uso dos materiais aqui mostrados e conforme descrito no protocolo online para manchas e mergulhos manuais. Prepare o criogen Dewar e o êmbolo manual. Para montar o criogen Dewar, primeiro instale a base de plataforma na parte inferior do isopor azul Dewar, garantindo que ele seja plano e nivelado.Em seguida, coloque o suporte do vaso de etano em cima da base da plataforma e insira o vaso de etano de latão. Por fim, sitia a plataforma de armazenamento da grade giratória. Em seguida, localize o Dewar mergulhando na base do êmbolo manual.Centralizar o vaso de etano abaixo do braço mergulhando e proteger o Dewar mergulhando para a base. Para definir a altura manual, primeiro conecte fita fresca à base do braço mergulhador. Em seguida, aperte um par de pinças de fixação, envolvendo firmemente a fita ao redor do braço mergulhando e a base da pinça.Certifique-se de que as pinças estão firmemente presas tocando-as levemente. Segure o braço mergulhando e baixe lentamente a pinça no recipiente de etano de latão, deprimindo o pedal do pé. Ajuste a localização do Dewar mergulhando para que as pinças se localizem no meio do vaso de etano de latão.As pontas das pinças não devem entrar em contato com o tamanho ou a parte inferior do vaso de etano de latão para evitar danos à pinça e ao êmbolo manual. Uma vez definida a posição, reinicie o braço de mergulho manual. Prepare o Criogen.A preparação criogena deve ser realizada em uma sala bem ventilada e equipamentos de proteção individual adequados devem ser usados o tempo todo. Para começar, nitrogênio líquido pobre diretamente no Dewar mergulhando, parando quando o nível de nitrogênio líquido atinge o topo do vaso de etano de latão. O sistema deve ser frio o suficiente para prosseguir depois que o nitrogênio líquido parar de borbulhar violentamente.Isso levará aproximadamente cinco minutos. O etano vem como um gás comprimido e precisa ser condensado. Para definir o fluxo de gás para condensação ideal de etano, insira a ponta da linha de gás etano em um béquer de 250 mil béquer de água e observe o borbulhante.O fluxo de gás deve produzir um fluxo constante de bolhas que não perturbam violentamente a superfície da água. Para começar a condensar o etano, coloque a ponta da linha de gás etano no fundo do vaso de etano de latão. Mexa lentamente a ponta metálica e comece a liquefazer o etano.Assim que o etano começar a esfriar, ele vai fazer um barulho audível. Encha o recipiente de etano de latão para três quartos cheio de etano líquido. Cubra o Dewar mergulhando com nitrogênio líquido, garantindo que ele toque o vaso de etano de latão, mas não derrame nele.A adição de nitrogênio líquido é necessária para o congelamento uniforme de etano. Coloque a tampa de espuma sobre o Dewar mergulhando azul, e deixe o etano solidificar completamente. Reinicie o fluxo de gás etano e coloque cuidadosamente a ponta da linha de gás no etano sólido.É importante colocar a ponta verticalmente no vaso e distribuir etano na parte inferior. Mexa lentamente a ponta metálica para derreter o etano e leve o nível de etano líquido até o topo do vaso. Feche a tampa por aproximadamente um minuto e deixe que o etano solidifique ao redor das bordas do vaso de latão até que dois a três milímetros de etano sólido sejam visíveis.O etano está agora a uma temperatura ideal para congelar amostras biológicas. Conecte o Dewar mergulhando cuidadosamente à base do êmbolo manual. Aperte um par de pinças de fixação envolvendo com segurança a fita ao redor do braço mergulhando e a base da pinça.Segure o braço mergulhando e baixe lentamente a pinça no etano líquido, deprimindo o pedal do pé. Ajuste a localização do Dewar mergulhando para que as pinças se localizem no meio do etano líquido, evitando contato com o anel de etano sólido. Prepare materiais e acessórios de mergulho.Prepare o papel de mancha cortando cada papel filtro circular em tiras de aproximadamente um centímetro de largura. Evite tocar no centro do papel manchador e descarte as peças finais menores. É importante garantir que as tiras de papel manchado estejam secas, limpas e livres de contaminantes.Antes de mergulhar, coloque as caixas de grade no Dewar mergulhando nas ranhuras adequadas. Certifique-se de que a grade cobre nossa livre para girar. Prepare espécimes crioEM por mergulhar congelando.Devido à diversidade de preparações de grade e grade, siga protocolos recomendados para a tornando as redes hidrofílicas. Para manusear corretamente as grades, use pinças limpas e secas para pegar as redes hidrofílicas no anel externo. Deslize o grampo de plástico para fixar a grade e bata suavemente na pinça para garantir que a grade esteja bem fixada.Aplique três microliters de amostra na frente da grade mantida na pinça de fixação. Coloque firmemente a pinça no braço manual, enrolando a fita ao redor da base da pinça. A amostra está pronta para ser borrada e mergulhada.Segure cada extremidade de uma tira limpa de papel manchador entre os dedos indicadores e os polegares. Coloque as mãos na borda do Dewar mergulhando para estabelecer uma posição estável. O papel de mancha deve estar a aproximadamente um centímetro da superfície da rede.Dobre o papel de mancha até que o centro entre em contato com a grade. É importante que o papel de mancha seja paralelo à superfície da rede para permitir o contato e evitar danos na rede. Quando a frente líquida móvel parar de se espalhar, comece a contar.Limpe a grade por cinco segundos. Estalar os dedos, esticando o papel manchador e removendo-o rapidamente da superfície da rede. Simultaneamente, pressione o pedal do pé para soltar o braço de mergulho manual, mergulhando a pinça segurando a grade no etano líquido.Mantendo a grade recém congelada no etano líquido, retire cuidadosamente as pinças do braço de mergulho manual. Despretou cuidadosamente as pinças para que a grade seja removível. Mova a rede para o reservatório de nitrogênio líquido abaixo do vaso de etano de latão com um movimento rápido do etano para o nitrogênio líquido.Coloque a grade na caixa da grade. Resultados representativos. A partir deste vídeo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar grades CryoEM, como esta, com muitos quadrados contendo filmes finos de gelo vítreo para imagens de alta resolução.A concentração da amostra e o tempo de mancha podem ser ajustados para otimizar a densidade de partículas. Aqui, demonstraremos o fluxo de trabalho completo para congelar amostras de CryoEM usando o método de mancha e mergulho. Use uma pinça de fixação limpa para pegar uma grade fresca e fixar a grade no lugar.Aplique três microliters de amostra no lado hidrofílico da rede e proteja pinças no braço de mergulho manual, envolvendo a fita ao redor da alça da pinça. Posicione o papel de mancha paralela à superfície da grade e dobre suavemente o papel de mancha em direção à grade para iniciar a mancha. Após o tempo desejado, mova o papel manchador em um movimento de estalo para longe da superfície da grade enquanto deprimi o pedal do pé para soltar o braço mergulhando, mergulhando a grade no etano líquido.Descontrate cuidadosamente a fita ao redor da pinça e o braço de mergulho manual. Com um movimento rápido, transfira rapidamente a rede do navio de etano para o reservatório de nitrogênio líquido. Coloque a grade na caixa de armazenamento da grade e enrole as pinças em um Kim Wipe para secar;repita.

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