Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим членов лаборатории Herzik за критическое мышление и предоставление отзывов об этой рукописи и видеоконтенте. M.A.H.Jr. поддерживается NIH R35 GM138206 и как стипендиат Searle. H.P.M.N поддерживается грантом на обучение молекулярной биофизике (NIH T32 GM008326). Мы также хотели бы поблагодарить Билла Андерсона, Чарльза Боумана и доктора Габриэля Ландера из Научно-исследовательского института Скриппса за помощь в проектировании, сборке и тестировании ручного плунжера, показанного в видео.

1. Подготовьте ручную среду погружения
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 5-30 минут
<ol><li>Расположите ручной плунжер в холодильной камере с температурой 4 °C, где может быть расположен увлажнитель воздуха для поддержания в помещении близкой к 100% относительной влажности (RH...

Витрификация биологических образцов для визуализации с помощью криогенной электронной микроскопии с одной частицей (криоЭМ) остается критически важным шагом для успешного определения структуры. Ручной метод пятнистости и погружения, описанный в этом протоколе, представляет собой эк...

Одночастичная криогенная электронная микроскопия (криоЭМ) является мощным структурным методом, который может быть использован для решения структур динамических биологических образцов с околоатомным разрешением1,2,3,4. Действительно, последние достижения в технологиях прямых детекторов электронов4,5,6,7,8,9,10, улучшения в электронных источниках4,11,12,13,14 и стабильности электромагнитных линз15 в сочетании с продолжающимся развитием сбора данных 16,17 и пакеты программного обеспечения для анализа18,19 позволили исследователям в настоящее время регулярно определять структуры хорошо ведущих себя образцов с разрешением 3 Å или лучше4,11,13,14,20,21,22,23 . Несмотря на эти улучшенные возможности визуализации и обработки данных, подготовка сетки криоЭМ остается самым большим препятствием для успешного определения структуры с высоким разрешением и часто служит значительным узким местом в рабочем процессе EM24,25,26,27.
CryoEM полагается на визуализацию биологических образцов в водных растворах, которые замораживаются с образованием тонкой пленки «стеклоподобного» льда - процесс, известный как витрификация - который сохраняет исходное биохимическое состояние. Витрификация биологических образцов для криоЭМ насчитывает более 40 лет28,29,30, и многие методы и оборудование, которые были разработаны для этого процесса, основаны на первоначально детальном методе пятнистости и погружения31,32,33,34,35 , при этом небольшой объем образца (например, 1-5 мкл) наносится на специализированную ЭМ-сетку перед удалением избыточного раствора с помощью физического взаимодействия сетки с промокательной бумагой. Сроки этого процесса обычно эмпирически определяются для каждого образца, поскольку критическим компонентом замораживания образцов является толщина стекловидной ледяной пленки - если лед слишком толстый, то качество изображения резко ухудшается из-за увеличения рассеяния электронного пучка, в то время как слишком тонкий лед может ограничивать ориентацию белка и / или исключать частицы из центра отверстий фольги сетки36 . Эта зависимость от идеальной толщины льда для криоЭМ с одной частицей привела к широкому спектру методов и оборудования, которые могут замораживать образцы, включая робототехнику37,38, микрофлюидику42 и ультразвуковые или распылительные устройства27,39,40,41,42,43,44 . В последние годы некоторые из самых популярных устройств для подготовки образцов полагаются на использование робототехники для автоматизированной заморозки образцов с использованием метода пятнистости и погружения45. Хотя эти устройства предназначены для воспроизводимого создания надлежащей толщины льда для визуализации, они часто остаются слишком дорогими для отдельных лабораторий для покупки и эксплуатации и, как правило, находятся в криоЭМ-объектах по почасовым ставкам для использования. В последние годы оригинальная ручная техника промокания и погружения вернулась в более широкое использование3,47,48,49,50,51,52. Действительно, устройство с ручным управлением может достигать высококачественных криоЭМ-сетей за небольшую часть стоимости роботизированных аналогов. Кроме того, ручное блоттинг также предлагает пользователям больше контроля над блоттингом, поскольку исследователи могут корректировать тип блоттинга (т. Е. Обратное блоттирование сетки, переднее блоттирование сетки и т. Д.), И время блоттинга на основе каждого отдельного образца и исследовательских вопросов.
В этой статье мы подробно расскажем о том, как эффективно замораживать биологические образцы с помощью традиционного ручного устройства витрификации в сочетании с специально разработанной платформой dewar53. Приведены лучшие практики, включая подготовку криогена, обработку сетки, применение образцов и блоттинг, а также распространенные подводные камни и рекомендации о том, как преодолеть эти препятствия. Обсуждаются рекомендации о том, как увеличить воспроизводимость толщины льда между препаратами сетки и как модифицировать блоттинг образцов на основе типа биологического образца. Учитывая низкую стоимость, связанную с покупкой и эксплуатацией ручного плунжера, описанного в этой рукописи, лаборатории по всему миру могут подготовить биологические образцы для криоЭМ экономически эффективным и воспроизводимым способом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

Визуализация биологических образцов с электронами для определения структуры высокого разрешения с помощью криогенной электронной микроскопии с одной частицей (криоЭМ) требует тонкого слоя стекловидного льда, содержащего биомолекулы, представляющие интерес. Несмотря на многочисленные технологические достижения в последние годы, которые вывели криоЭМ на передний план структурной биологии, методы, с помощью которых образцы остекливаются для визуализации с высоким разрешением, часто остаются этапом ограничения скорости. Хотя многочисленные недавние усилия обеспечили средства для преодоления препятствий, часто встречающихся во время витрификации образцов, включая разработку новых опор для образцов и инновационных приборов для витрификации, традиционный плунжер с ручным управлением остается основным продуктом в сообществе криоЭМ из-за низкой стоимости покупки и простоты эксплуатации. Здесь мы приводим подробные методы использования стандартного гильотинного устройства с ручным управлением для витрификации биологических образцов для визуализации с высоким разрешением с помощью криоЭМ. Кроме того, также описываются часто встречающиеся проблемы и рекомендации по устранению неполадок, когда стандартная подготовка не дает подходящего образца.

Успешное выполнение протокола пятнистости и погружения, описанного здесь, приведет к созданию тонкого, однородного слоя стекловидного льда, свободного от любого шестиугольного льда, загрязняющих веществ и больших градиентов непригодного льда, которые можно наблюдать под электронным...

Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

В этой рукописи описывается метод блоттинга и погружения для ручной заморозки биологических образцов для криогенной электронной микроскопии с одной частицей.

Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Описанный здесь метод ручного погружения является экономически эффективным и надежным методом подготовки образцов для просвечивающей электронной микроскопии. В этом видео мы продемонстрируем, как настроить ручной плунжер, подготовить криоген и выполнить ручное промокание и погружение электромагнитных сетей. Подготовьте ручную среду погружения.Эта процедура должна выполняться в холодном помещении, поддерживаемом при температуре 40 градусов цельсия с влажностью более 95% Мы рекомендуем использовать материалы, показанные здесь и как описано в онлайн-протоколе для ручного промокания и погружения. Подготовьте криоген Дьюара и ручной плунжер. Чтобы собрать криоген Дьюара, сначала установите основание платформы в нижней части синего пенопласта Дьюара, убедившись, что оно плоское и ровное.Затем поместите держатель этанового сосуда поверх основания платформы и вставьте латунный сосуд с этаном. Наконец, расположите вращающуюся сетевую платформу для хранения. Затем найдите погружающийся Дьюар к основанию ручного плунжера.Центрируйте этановый сосуд ниже погружающегося рычага и закрепите погружающегося Дьюара на базу. Чтобы установить ручную высоту погружения, сначала прикрепите свежую ленту к основанию погружающего рычага. Затем закрепите пару зажимных пинцетов, надежно обернув ленту вокруг погружающего рычага и основания пинцета.Убедитесь, что пинцет прочно прикреплен, слегка постукивая по ним. Удерживайте погружающуюся руку и медленно опустите пинцет в латунный этановый сосуд, нажав на ножную педаль. Отрегулируйте расположение погружающегося Дьюара так, чтобы пинцет располагался к середине латунного этанового сосуда.Наконечники пинцета не должны соприкасаться с размером или дном латунного этанового сосуда, чтобы избежать повреждения пинцета и ручного плунжера. После того, как положение установлено, сбросьте ручной погружной рычаг. Подготовьте криоген.Подготовка криогена должна проводиться в хорошо проветриваемом помещении, а соответствующие средства индивидуальной защиты должны постоянно носиться. Для начала бедный жидкий азот непосредственно попадает в погружающийся Дьюар, останавливаясь, когда уровень жидкого азота достигает вершины латунного этанового сосуда. Система должна быть достаточно холодной, чтобы продолжать работу после того, как жидкий азот перестанет бурлить.Это займет примерно пять минут. Этан поступает в виде сжатого газа и нуждается в конденсации. Чтобы установить поток газа для оптимальной конденсации этана, вставьте наконечник газовой линии этана в стакан воды на 250 мил и наблюдайте за бурлением.Поток газа должен производить устойчивый поток пузырьков, который не нарушает бурно поверхность воды. Чтобы начать конденсацию этана, поместите наконечник газопровода этана на дно латунного этанового сосуда. Медленно перемешайте металлический наконечник и начните разжижать этан.Как только этан начнет остывать, он издаст слышимый шум. Наполните латунный этановый сосуд до трех четвертей, заполненных жидким этаном. Дополните погружающийся Дьюар жидким азотом, следя за тем, чтобы он касался латунного этанового сосуда, но не пролился в него.Добавление жидкого азота необходимо для равномерного замораживания этана. Поместите пенную крышку на синий погружающийся Дьюар и дайте этану полностью затвердеть. Перезапустите поток газа этана и осторожно поместите наконечник газовой магистрали в твердый этан.Важно поместить наконечник вертикально в сосуд и дозировать этан на дно. Медленно перемешайте металлический наконечник, чтобы расплавить этан и довести уровень жидкого этана до верхней части сосуда. Закройте крышку примерно на одну минуту и дайте этану затвердеть по краям латунного сосуда до тех пор, пока не будет видно два-три миллиметра твердого этана.Этан в настоящее время находится при температуре, идеально подходящей для замораживания биологических образцов. Аккуратно прикрепите погружной Дьюар к основанию ручного плунжера. Закрепите пару зажимных пинцетов, надежно обернув ленту вокруг погружающего рычага и основания пинцета.Удерживайте погружающуюся руку и медленно опустите пинцет в жидкий этан, нажав на ножную педаль. Отрегулируйте расположение погружающегося Дьюара так, чтобы пинцет располагался к середине жидкого этана, избегая контакта с твердым этановым кольцом. Подготовьте погружные материалы и аксессуары.Подготовьте промокательную бумагу, разрезав каждую круглую фильтровальную бумагу на полоски шириной около одного сантиметра. Избегайте прикосновения к центру промокательной бумаги и отбросьте меньшие концевые кусочки. Важно убедиться, что полоски промокательной бумаги являются сухими, чистыми и свободными от загрязнений.Перед погружением поместите коробки сетки в погружающийся Дьюар в соответствующие слоты. Убедитесь, что сетка покрывает нашу свободную ротацию. Подготовьте образцы CryoEM методом погружной заморозки.В связи с разнообразием сетки и подготовки сетки, следуйте рекомендуемым протоколам для придания сеткам гидрофильной. Чтобы правильно обращаться с сетками, используйте чистый, сухой зажимной пинцет, чтобы подобрать гидрофильные решетки на внешнем кольце. Сдвиньте пластиковый зажим, чтобы закрепить сетку, и осторожно постучите пинцетом, чтобы убедиться, что сетка правильно зажата.Нанесите три микролитра образца на переднюю часть сетки, удерживаемой в зажимном пинцете. Плотно прикрепите пинцет к ручному погружному рычагу, обернув ленту вокруг основания пинцета. Теперь образец готов к смачиванию и погружению в замороженное состояние.Держите каждый конец чистой полоски промокательной бумаги между указательными и большими пальцами. Положите руки на край погружающегося Дьюара, чтобы установить стабильное положение. Промокательная бумага должна находиться примерно в одном сантиметре от поверхности сетки.Согните промокательную бумагу до тех пор, пока центр не соприкоснется с сеткой. Важно, чтобы промокательная бумага была параллельна поверхности сетки, чтобы обеспечить равномерный контакт и предотвратить повреждение сетки. Когда подвижный жидкий фронт перестанет распространяться, начинайте подсчет.Промокните сетку в течение пяти секунд. Раздвиньте пальцы, напрягая промокательную бумагу и быстро снимая ее с поверхности сетки. Одновременно нажмите ножную педаль, чтобы отпустить ручной погружной рычаг, погружая пинцет, удерживающий сетку, в жидкий этан.Удерживая свежезамороженную сетку в жидком этане, тщательно отсоедините пинцет от ручного погружного рычага. Осторожно отсоедините пинцет, чтобы сетка была съемной. Переместите сетку в резервуар жидкого азота под латунным этановым сосудом одним быстрым движением от этана к жидкому азоту.Поместите сетку в поле сетки. Репрезентативные результаты. Из этого видео исследователи должны быть в состоянии подготовить сетки CryoEM, такие как этот, со многими квадратами, содержащими тонкие пленки стекловидного льда для изображения с высоким разрешением.Концентрация образца и время промокания могут быть отрегулированы для оптимизации плотности частиц. Здесь мы продемонстрируем полный рабочий процесс замораживания образцов CryoEM с использованием метода blot and plunge. Используйте чистый зажимной пинцет, чтобы подобрать свежую сетку и закрепить сетку на месте.Нанесите три микролитра образца на гидрофильную сторону сетки и закрепите пинцет на ручном погружном рычаге, обернув ленту вокруг ручки пинцета. Расположите промокательную бумагу параллельно поверхности сетки и осторожно согните промокательную бумагу по направлению к сетке, чтобы начать промокание. По истечении нужного количества времени переместите промокательную бумагу в отрыв от поверхности сетки, одновременно нажимая на ножную педаль, чтобы освободить погружающуюся руку, погружая сетку в жидкий этан.Осторожно размотайте ленту вокруг пинцета и ручного погружающего рычага. Одним быстрым движением быстро перенесите сетку из этанового сосуда в резервуар жидкого азота. Поместите сетку в ящик для хранения сетки и оберните пинцет в салфетку Kim Wipe для высыхания; повторите.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Количественная оценка распределения субклеточного гликогена в волокнах скелетных мышц с помощью просвечивающей электронной микроскопии

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...