Name: manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Herzik laboratuvar üyelerine bu makale ve video içeriği hakkında eleştirel düşünmeleri ve geri bildirimde bulunmaları için teşekkür ederiz. M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 ve Searle Scholar tarafından desteklenmektedir. H.P.M.N Moleküler Biyofizik Eğitim Hibesi (NIH T32 GM008326) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Scripps Araştırma Enstitüsü'ndeki Bill Anderson, Charles Bowman ve Dr. Gabriel Lander'a videoda gösterilen manuel pistonun tasarlanması, montajı ve testine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

1. Manuel dalma ortamını hazırlayın
NOT: Tahmini çalışma süresi: 5-30 dakika
<ol><li>Manuel pistonu, odayı %100 bağıl neme (RH) yakın tutmak için bir nemlendiricinin birlikte bulunabileceği 4 °C soğuk bir odada bulun (Şekil 1A). DİkKAT: Manuel pistonun güvenli konumu ve önerilen işlemler için lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın.</li>
	<li>Izgara hazırlamadan önce, soğuk odanın RH'sinin% 95'≥ emin...

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu, başarılı yapı tespiti için kritik öneme sahip bir adım olmaya devam etmektedir. Bu protokolde açıklanan manuel blot-and-plunge yöntemi, cryoEM görüntüleme için ince vitreus buz filmlerindeki biyolojik örneklerin hızlı bir şekilde dondurulması için uygun maliyetli, güvenilir ve sağlam bir yöntemi temsil eder. Araştırmacılar, el yazmasında belirtilen yöntemleri kullanarak ma...

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM), dinamik biyolojik örneklerin yapılarını atoma yakın çözünürlüğe çözmek için kullanılabilecek güçlü bir yapısal tekniktir1,2,3,4. Nitekim, doğrudan elektron dedektörü teknolojilerindeki son gelişmeler4,5,6,7,8,9,10, elektron kaynaklarında iyileşmeler4,11,12,13,14 ve elektromanyetik lens stabilitesi15, veri toplamanın sürekli gelişimi ile birleştiğinde 16,17 ve analiz yazılım paketleri18,19, araştırmacıların artık 3 şçözünürlüğe veya daha iyi 4,11,13,14,20,21,22,23'e iyi huylu örneklerin yapılarını rutin olarak belirlemelerini sağladı . Bu gelişmiş görüntüleme ve veri işleme yeteneklerine rağmen, cryoEM ızgara hazırlığı başarılı yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için en büyük engel olmaya devam ediyor ve genellikle EM iş akışında önemli bir darboğaz görevi görüyor24,25,26,27.
CryoEM, biyolojik örneklerin, yerel biyokimyasal durumu koruyan "cam benzeri" buzun ince bir filmini oluşturmak için dondurulan sulu çözeltilerde görüntülenmesine dayanır - vitrifikasyon olarak bilinen bir süreç. CryoEM için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu 40 yıl öncesine dayanıyor28,29,30 ve bu işlem için geliştirilen birçok teknik ve ekipman başlangıçta ayrıntılı blot ve dalma yöntemine güveniyor31,32,33,34,35 , örneğin, 1-5 μL) küçük bir numune hacminin, ızgaranın şişirme kağıdı ile fiziksel etkileşimi kullanılarak fazla çözelti çıkarılmadan önce özel bir EM ızgarasına uygulandığı yer. Bu işlemin zamanlaması genellikle her numune için ampirik olarak belirlenir, çünkü donma örneklerinin kritik bir bileşeni vitreus buz filminin kalınlığıdır - buz çok kalınsa, çok ince olan buz protein yönelimlerini kısıtlayabilir ve / veya parçacıkları ızgara folyo deliklerinin merkezinden dışlayabilirken elektron ışınının daha fazla saçılması nedeniyle görüntüleme kalitesi önemli ölçüde bozulur36 . Tek parçacıklı cryoEM için mükemmel buz kalınlığına olan bu güven, robotik37,38, mikroakışkanlar42 ve ultrasonik veya püskürtme cihazları27,39,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere örnekleri dondurabilen çok çeşitli teknik ve ekipmanlara yol açmıştır. . Son yıllarda, en popüler numune hazırlama cihazlarından bazıları, blot ve dalma tekniğini kullanarak numunelerin otomatik olarak dondurulması için robotik kullanımına güveniyor45. Bu cihazlar görüntüleme için uygun buz kalınlığını yeniden oluşturmak üzere tasarlanmış olsa da, genellikle bireysel laboratuvarların satın alması ve çalışması için çok pahalı kalır ve genellikle kullanım için saatlik fiyatlarla cryoEM tesislerinde bulunur. Son yıllarda, orijinal manuel blot-and-plunge tekniği artmış kullanıma geri döndü3,47,48,49,50,51,52. Gerçekten de, elle çalıştırılan bir blot-and-plunge cihazı, robotik meslektaşlarının maliyetinin çok altında yüksek kaliteli cryoEM ızgaraları elde edebilir. Ayrıca, manuel şişkinlik, araştırmacılar her bir örnek ve araştırma sorusuna göre şişkinlik türünü (örneğin, ızgaranın geri blottingi, ızgaranın ön blottingi vb.) ve blotting süresini ayarlayabildiğinden, daha fazla kullanıcıya şişkinlik üzerinde kontrol sağlar.
Bu makalede, özel tasarlanmış bir dewar platformu53 ile birlikte geleneksel bir manuel blot ve dalma vitrifikasyon cihazı kullanarak biyolojik örneklerin etkili bir şekilde nasıl dondurulacağı hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz. Kriyojenin hazırlanması, ızgara işleme, örnek uygulama ve şişkinlik dahil olmak üzere en iyi uygulamaların yanı sıra bu engellerin nasıl aşılacağına dair yaygın tuzaklar ve öneriler sağlanmaktadır. Izgara preparatları arasında buz kalınlığı tekrarlanabilirliğinin nasıl artırılacağı ve numune şişkinliğinin biyolojik numune tipine göre nasıl değiştirilerek değiştirilmeleri konusunda tavsiyeler tartışılmıştır. Bu yazıda açıklanan manuel pistonun satın alınması ve işletilmesiyle ilgili düşük maliyet göz önüne alındığında, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar cryoEM için biyolojik örnekleri uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde hazırlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 slot grid storage box</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 gauge flat metal dispensing tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07M7YWWLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square glass coverslip</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9802-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm glass Petri dish to store grids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-747F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue styrofoam dewar</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass ethane vessel</td>
			<td>Lasco</td>
			<td>17-4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage regulator with control valve</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12N245D580-AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewer grid base</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane platform</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane propane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>ET PR50ZU-G</td>
			<td>ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1035</td>
			<td>ethane (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible arm task light</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>LED-11CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q325AR1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>Target</td>
			<td>719438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>ThermoPro</td>
			<td>B01H1R0K68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coat</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen dewar</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-059-925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark 5 (plunging platform)</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82026-424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-690-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E0030124286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>ibis scientific</td>
			<td>63300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMR4H8G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety glasses</td>
			<td>UCSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Fiskars 01-004761J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw driver</td>
			<td>Ironside</td>
			<td>354711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer to transfer grid box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>LTS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-171-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için elektronlu biyolojik örneklerin görüntülenmesi, ilgi çekici biyomolekülleri içeren ince bir vitreus buz tabakası gerektirir. Son yıllarda tek parçacıklı cryoEM'i yapısal biyolojinin ön saflarına taşıyan çok sayıda teknolojik ilerlemeye rağmen, numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için vitrifiye edildiği yöntemler genellikle hız sınırlayıcı adım olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda çok sayıda çaba, yeni örnek desteklerinin geliştirilmesi ve yenilikçi vitrifikasyon enstrümantasyonu da dahil olmak üzere numune vitrifikasyonu sırasında sıkça karşılaşılan engellerin üstesinden gelmek için araçlar sağlasa da, geleneksel manuel olarak işletilen piston, düşük satın alma maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle cryoEM topluluğunda temel bir unsur olmaya devam etmektedir. Burada, tek parçacıklı cryoEM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu için standart, giyotin tarzı elle çalıştırılan blot ve dalma cihazını kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, standart bir preparat uygun bir numune veremediğinde sık karşılaşılan sorunlar ve sorun giderme önerileri de açıklanmıştır.

Burada açıklanan blot ve dalma protokolünün başarılı bir şekilde yürütülmesi, elektron mikroskobu altında gözlemlenebilen altıgen buz, kirleticiler ve kullanılamaz buzun büyük gradyanlarından arınmış ince, düzgün bir vitreus buz tabakası ile sonuçlanacaktır (Şekil 3). Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyi ile tutarsız teması, şişkin kağıdın zamanından önce çıkarılması veya ızgara teması sırasında şişkin kağıdın hareket ettirilerek vitreus ...

Watch this Scientific Journal Video about Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy at JoVE.com

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Burada açıklanan manuel dalma yöntemi, numuneleri iletim elektron mikroskopisi için hazırlamak için uygun maliyetli, güvenilir bir yöntemdir. Bu videoda, manuel pistonun nasıl kurulacağını, kriyojenin nasıl hazırlanacağını ve EM ızgaralarının manuel olarak nasıl şişirilmiş ve dalma yapılacağını göstereceğiz. Manuel Dalma Ortamını hazırlayın.Bu prosedür, %95'ten büyük nem oranına sahip 40 santigrat derecede tutulan soğuk bir odada yapılmalıdır Burada gösterilen ve manuel şişkinlik ve dalma için çevrimiçi protokolde açıklandığı gibi malzemeleri kullanmanızı öneririz. Kriyojen Dewar ve Manuel Pistonu hazırlayın. Kriyojen Dewar'ı monte etmek için, önce platform tabanını mavi strafor Dewar'ın altına monte edin ve düz ve düz olmasını sağlayın.Daha sonra etan kap tutucuyu platform tabanının üzerine yerleştirin ve pirinç etan kabını yerleştirin. Son olarak, dönen ızgara depolama platformunu oturtun. Ardından, dalgıç Dewar'ı manuel pistonun tabanına bulun.Etan kabını dalma kolunun altına ortalayın ve dalgıç Dewar'ı üsse sabitleyin. Manuel dalma yüksekliğini ayarlamak için, önce dalma kolunun tabanına taze bant takın. Ardından, bandı dalma koluna ve cımbız tabanına güvenli bir şekilde sararak bir çift sıkma cımbızı bağlayın.Cımbızın hafifçe dokunarak sıkıca takıldığından emin olun. Dalma kolunu tutun ve ayak pedalını bastırarak cımbızı yavaşça pirinç etan kabına 2007'den fazla haline haline alın. Dalma Dewar'ın konumunu, cımbızın pirinç etan kabının ortasına yermesi için ayarlayın.Cımbız uçları, cımbızın ve manuel pistonun zarar görmesini önlemek için pirinç etan kabının boyutuna veya altına temas etmemelidir. Konum ayarlandıktan sonra manuel dalma kolunu sıfırlayın. Cryogen'i hazırlayın.Kriyojen hazırlığı iyi havalandırılmış bir odada yapılmalı ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. Başlamak için, zayıf sıvı nitrojen doğrudan dalma Dewar içine, sıvı nitrojen seviyesi pirinç etan kabının tepesine ulaştığında durur. Sistem, sıvı nitrojen şiddetli bir şekilde köpürmeyi durdurduktan sonra devam edecek kadar soğuk olmalıdır.Bu yaklaşık beş dakika sürecektir. Etan sıkıştırılmış gaz olarak gelir ve yoğunlaştırılması gerekir. Optimum etan yoğunlaşma için gaz akışını ayarlamak için, etan gazı hattının ucunu 250 millik bir su kabına yerleştirin ve köpürmeyi gözlemleyin.Gaz akışı, su yüzeyini şiddetli bir şekilde bozmayan sabit bir kabarcık akışı üretmelidir. Etan yoğuşmaya başlamak için, etan gazı hattının ucunu pirinç etan kabının altına yerleştirin. Metal ucu yavaşça karıştırın ve etanları sıvılaştırmaya başlayın.Etan soğumaya başlar başlamaz, duyulabilir bir ses çıkarır. Pirinç etan kabını sıvı etan dolu dörtte üçüne doldurun. Dalgıç Dewar'ı sıvı nitrojenle kaplayın, pirinç etan kabına dokunmasını ancak içine dökülmemesini sağlayın.Sıvı nitrojenin eklenmesi, tek tip etan dondurma için gereklidir. Köpük kapağı mavi dalgıç Dewar üzerine yerleştirin ve etan tamamen katılaşmak için izin verin. Etan gazı akışını yeniden başlatın ve gaz hattının ucunu dikkatlice katı etan içine yerleştirin.Ucun kabın içine dikey olarak yerleştirilmesi ve tabana etan dağıtılması önemlidir. Etanları eritmek ve sıvı etan seviyesini kabın tepesine çıkarmak için metal ucu yavaşça karıştırın. Kapağı yaklaşık bir dakika kapatın ve etan, iki ila üç milimetre katı etan görünene kadar pirinç kabın kenarlarının etrafında katılaşmaya izin verin.Etan şimdi biyolojik numuneleri dondurmak için ideal bir sıcaklıkta. Dalma Dewar'ı manuel pistonun tabanına dikkatlice takın. Bandı dalma koluna ve cımbız tabanına güvenli bir şekilde sararak bir çift sıkma cımbızı sabitleyin.Dalma kolunu tutun ve ayak pedalını bastırarak cımbızı yavaşça sıvı etan içine dirayaklayın. Dalma Dewar'ın konumunu, cımbızın sıvı etan ortasına yer edinecek şekilde ayarlayın ve katı etan halkasıyla temastan kaçının. Dalgıç Malzemeleri ve Aksesuarları hazırlayın.Her dairesel filtre kağıdını yaklaşık bir santimetre genişliğinde şeritler halinde keserek şişkin kağıdı hazırlayın. Şişkin kağıdın ortasına dokunmaktan kaçının ve daha küçük uç parçalarını atın. Şişkin kağıt şeritlerinin kuru, temiz ve kirletici içermemesini sağlamak önemlidir.Dalmadan önce, ızgara kutularını dalma Dewar'a uygun yuvalara yerleştirin. Izgaranın döndürme özgürlüğümüzü kapsadığından emin olun. Dondurucuya Dalarak CryoEM Örneklerini Hazırlayın.Şebeke ve ızgara preparatlarının çeşitliliği nedeniyle, şebekelerin hidrofilik hale getirilmesi için önerilen protokolleri izleyin. Izgaraları düzgün bir şekilde işlemek için, dış halkadaki hidrofilik ızgaraları almak için temiz, kuru sıkma cımbızları kullanın. Izgaranın sabitlenebilmesi için plastik kelepçeyi kaydırın ve ızgaranın düzgün bir şekilde kenetlendiğini sağlamak için cımbızlara hafifçe dokunun.Sıkma cımbızında tutulan ızgaranın önüne üç mikrolitre numune uygulayın. Bandı cımbız tabanının etrafına sararak cımbızları manuel dalma koluna sıkıca takın. Örnek artık şişirilmeye ve dondurulmaya hazır.Temiz bir şişkinlik kağıdı şeridinin her ucunu işaret parmaklarınız ve başparmaklarınız arasında tutun. İstikrarlı bir pozisyon oluşturmak için ellerinizi dalgıç Dewar'ın kenarına koyun. Şişkinlik kağıdı ızgaranın yüzeyinden yaklaşık bir santimetre olmalıdır.Ortadaki ızgarayla temas edene kadar şişkinlik kağıdını bükün. Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyine paralel olması, eşit temasa izin vermek ve ızgara hasarını önlemek için önemlidir. Mobil sıvı ön yayılmayı durdurduğunda saymaya başlayın.Izgarayı beş saniyeliğine lekele. Parmaklarınızı birbirinden ayırın, şişkin kağıdı gerin ve ızgaranın yüzeyinden hızla çıkarın. Aynı anda, manuel dalma kolunu serbest bırakmak için ayak pedalına basın, ızgarayı tutan cımbızı sıvı etan içine daldırın.Taze donmuş ızgarayı sıvı etan içinde tutarak, cımbızları manuel dalma kolundan dikkatlice ayırın. Cımbızı dikkatlice çıkarın, böylece ızgara çıkarılabilir. Izgarayı pirinç etan kabının altındaki sıvı azot rezervuarına, etandan sıvı nitrojene hızlı bir hareketle hareket ettirin.Izgarayı kılavuz kutusuna yerleştirin. Temsili Sonuçlar. Bu videodan araştırmacılar, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince vitreus buz filmleri içeren birçok kare ile bunun gibi CryoEM ızgaralarını hazırlayabilmelidir.Numune konsantrasyonu ve şişkinlik süresi parçacık yoğunluğunu optimize etmek için ayarlanabilir. Burada, blot ve plunge yöntemini kullanarak CryoEM örneklerini dondurmak için tam iş akışını göstereceğiz. Taze bir ızgara almak ve ızgarayı yerinde sabitlemek için temiz bir sıkma cımbızı kullanın.Izgaranın hidrofilik tarafına üç mikrolitre numune uygulayın ve bandı cımbız sapının etrafına sararak manuel dalma koluna cımbız sabitleyin. Şişkinlik kağıdını ızgara yüzeyine paralel yerleştirin ve şişkinliği başlatmak için şişkin kağıdı ızgaraya doğru hafifçe bükün. İstenilen sürenin ardından, lekeleme kağıdını ızgara yüzeyinden bir çıtlatma hareketiyle hareket ettirirken, ayak pedalını bastırarak dalma kolunu serbest bırakın, ızgarayı sıvı etan içine daldırın.Bandı cımbızın ve manuel dalma kolunun etrafından dikkatlice gevşetin. Hızlı bir hareketle, ızgarayı etan kaptan sıvı nitrojen rezervuarına hızlı bir şekilde aktarın. Izgarayı ızgara depolama kutusuna yerleştirin ve cımbızı kuruması için kim silmeye sarın;tekrarlayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...