Name: fluorescence microscopy for atp internalization mediated by macropinocytosis in human tumor cells and tumor-xenografted mice
Uploaded: 2021-06-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice at JoVE.com

La criosezione è stata eseguita in loco presso l'Ohio University Histopathology Core. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da fondi di start-up (Ohio University College of Arts & Sciences) a C Nielsen; NIH concede R15 CA242177-01 e premio RSAC a X Chen.

Tutte le procedure qui riportate sono state eseguite in conformità con la IACUC dell'Università dell'Ohio e con il NIH.
1. Selezione di ATP fluorescente non idrolizzabile (NHF-ATP) e dextrans
<ol><li>Selezionare un NHF-ATP coniugato con fluoroforo (Figura 1A) e traccianti di endocitosi, dextrans fluorescenti ad alto e basso peso molecolare (TMR-HMWFD e TMR-LMWFD) (Figura 1B), in base alle lunghezze d'onda di emissione preferite (a...

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+hallmarks+of+cancer+metabolism.">The emerging hallmarks of cancer metabolism.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Pellegatti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+level+of+extracellular+ATP+at+tumor+sites:+in+vivo+imaging+with+plasma+membrane+luciferase.">Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase.</a> PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).</li><li>Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+adenosine+triphosphate+in+the+pericellular+space.">Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-dependent+anticancer+immune+responses+induced+by+chemotherapeutic+agents+in+mice.">Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice.</a> Science. 334, 1573-1577 (2011).</li><li>Wilhelm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease+is+enhanced+by+extracellular+ATP+activating+P2X7R.">Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R.</a> Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).</li><li>Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Warburg+effect:+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation.">Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Science. 324, 1029-1033 (2009).</li><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).</li><li>Chen, X., Qian, Y., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Warburg+effect:+evolving+interpretations+of+an+established+concept.">The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 79, 253-263 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP,+as+an+energy+and+phosphorylating+molecule,+induces+different+types+of+drug+resistances+in+cancer+cells+through+ATP+internalization+and+intracellular+ATP+level+increase.">Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase.</a> Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).</li><li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+as+a+biological+hydrotrope.">ATP as a biological hydrotrope.</a> Science. 356, 753-756 (2017).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+is+internalized+by+macropinocytosis+and+induces+intracellular+ATP+increase+and+drug+resistance+in+cancer+cells.">Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells.</a> Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+a+new+player+in+cancer+metabolism:+NSCLC+cells+internalize+ATP+in+vitro+and+in+vivo+using+multiple+endocytic+mechanisms.">Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms.</a> Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+uptake+via+alpha2+adrenoceptor-mediated+PI3K+activation+following+brief+exposure+to+noradrenaline.">Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline.</a> Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).</li><li>Hoppe, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimalarial+quinolines+and+artemisinin+inhibit+endocytosis+in+Plasmodium+falciparum.">Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents &amp; Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).</li><li>Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+ATP+cross+the+cell+plasma+membrane.">Does ATP cross the cell plasma membrane.</a> Yale Journal of Biology &amp; Medicine. 55, 1-10 (1982).</li><li>Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+utilization+of+extracellular+[gamma-32P]ATP+for+the+phosphorylation+of+intracellular+proteins+in+the+squid+giant+axon.">Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).</li><li>Chaudry, I. H., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+evidence+for+ATP+uptake+by+rat+tissues.">Further evidence for ATP uptake by rat tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).</li><li>Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otto+Warburg's+contributions+to+current+concepts+of+cancer+metabolism.">Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).</li><li>Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Links+between+metabolism+and+cancer.">Links between metabolism and cancer.</a> Genes &amp; Development. 26, 877-890 (2012).</li><li>Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+consumption+promotes+cancer+metabolism.">ATP consumption promotes cancer metabolism.</a> Cell. 143, 669-671 (2010).</li><li>Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+and+insulin+secretion:+the+ATP-sensitive+K++channel+(K+ATP)+connection.">Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection.</a> Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).</li><li>Szendroedi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mitochondrial+ATP+synthesis+and+glucose+transport/phosphorylation+in+type+2+diabetes.">Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes.</a> PLoS Medicine. 4, 154 (2007).</li><li>Miyamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+reveals+elevated+glomerular+ATP/AMP+in+diabetes/obesity+and+identifies+sphingomyelin+as+a+possible+mediator.">Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator.</a> EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).</li></ol>

È stato sviluppato un metodo per l'analisi spaziale, temporale e quantitativa dell'internalizzazione cellulare dell'ATP non idrolizzabile. Questo metodo è ampiamente applicabile per l'uso in diversi sistemi biologici, compresi vari modelli tumorigenici, per i quali forniamo istruzioni tecniche e dati rappresentativi. Per acquisire dati interpretabili durante gli studi di internalizzazione dell'ATP in vivo (sezione 4 del protocollo), è fondamentale limitare il tempo sperimentale trascorso dall'iniezione intrat...

L'assorbimento opportunistico di nutrienti extracellulari intratumorali (cioè) è stato recentemente nominato un segno distintivo chiave per il metabolismo del cancro1. Uno di questi importanti nutrienti è l'ATP, in quanto la concentrazione di ieATP è10 3 e10 4 volte superiore a quella che si trova nei tessuti normali, nell'intervallo da diverse centinaia di μM a bassi mM2,3,4,5. Come molecola chiave di energia e segnalazione, l'ATP svolge un ruolo centrale nel metabolismo cellulare nelle cellule cancerose e sane6,7,8. L'ATP extracellulare non è solo coinvolto nella crescita delle cellule tumorali, ma promuove anche la resistenza ai farmaci9. Funzioni precedentemente non riconosciute dell'ATP, come l'attività idrotropica, sono state recentemente identificate, implicando così il coinvolgimento dell'ATP in malattie come l'Alzheimer10. In effetti, sembra che la nostra comprensione dell'ATP e delle sue funzioni nelle cellule tumorali, nelle cellule sane e in altre cellule malate sia tutt'altro che completa. Tuttavia, a causa dell'instabilità dell'ATP e degli alti tassi di turnover nelle cellule, è tecnicamente difficile monitorare il movimento dell'ATP attraverso la membrana cellulare e nella cellula.
Per affrontare questo problema e soddisfare le esigenze di questa area di ricerca, è stato sviluppato un metodo in cui l'ATP fluorescente non idrolizzabile (NHF-ATP) (Figura 1) è stato utilizzato come surrogato per visualizzare l'internalizzazione dell'ATP e osservare la localizzazione spaziale intracellulare dell'ATP internalizzato, sia in vitro che in vivo11,12 . NHF-ATP ha dimostrato di sostituire l'ATP endogeno per studiare il movimento dell'ATP attraverso le membrane cellulari animali, sia nelle linee cellulari tumorali che nel tessuto tumorale umano xenotrapiantato su topi immunodeficienti11,12. Inoltre, la somministrazione di inibitori della macropinocitosi alle cellule ha bloccato l'internalizzazione dell'eATP, suggerendo che l'assorbimento intracellulare di eATP comporta un meccanismo macropinocitotico9,11,12. Questo protocollo consente il colabeling immunobased contro proteine cellulari specifiche e quindi l'identificazione di quale tipo di cellula interiorizza NHF-ATP. Utilizzando xenotrapianti tumorali in vivo e microscopia ad alta risoluzione, NHF-ATP può essere visualizzato spazialmente attraverso il campione di tessuto e anche all'interno di una singola cellula. Questi metodi consentono anche analisi quantitative, come la percentuale di assorbimento cellulare, il numero di vescicole macropinocitotiche e la cinetica di internalizzazione. Questo articolo descrive in dettaglio come NHF-ATP, lavorando da solo o insieme adextrans13, 14,15,16fluorescenti endocitosi-traccianti, può essere utilizzato in diversi contesti sperimentali per studiare l'internalizzazione e la localizzazione intracellulare dell'ATP, a seguito dell'internalizzazione nelle cellule.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62768/62768fig01.jpg"> Figura 1: Strutture di ATP fluorescente non idrolizzabile e tetrametilrodramina etichettate come destrano fluorescente ad alto peso molecolare. (A) Struttura di NHF-ATP. (B) Rappresentazione schematica dell'HMWFD. Abbreviazioni: ATP = adenosina trifosfato; NHF-ATP = ATP fluorescente non idrolizzabile; TMR = tetrametilrodramina; HMWFD = destrano fluorescente ad alto peso molecolare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62768/62768fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells, human lung epithelial, carcinoma</td>
			<td>National Cancer Institute</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Less expensive source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, Reynolds</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6CHG6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP analog</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NK-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave, sterilizer</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>33ZZ40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades, cryostat, high profile</td>
			<td>C. L. Sturkey, Inc.</td>
			<td>DT554550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers, vernier</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4KU77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium, Ham&#39;s Nutrient Mixture F12, serum-free</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51651C-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423555000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 12 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat, Leica CM1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipe, Kim Wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>MW = 70,000, Tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Local delivery</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #7, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (small, medium, large)</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>N191, N192, N193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-046-563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF16034F EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, cell culture</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labelling tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pen, Sharpie (ultra-fine)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>642736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, immunodeficient (Nu/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge, accuSpin Micro17</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-4983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 27 gauge</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>752 0071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>39AL12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Staples</td>
			<td>33550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>416785000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (200 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets, serological (10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippetor, Gilson P2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF9930A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 &#956;L, 20-200 &#956;L, 200-1000 &#956;L)</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF9931A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform shaker - orbital, benchtop</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-51710-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides, Superfrost</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, surgical - sharp, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14005-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for image analysis, Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for image analysis, ImageJ (FIJI)</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Download online (free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047740044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tray, 245 mm BioAssay Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 cc</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, laboratory, 19 mm width</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-5R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask, 225 cm2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24-well</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold, stainless steel</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, Precision GP 2S</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>TSGP2S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy for atp internalization mediated by macropinocytosis in human tumor cells and tumor-xenografted mice

L'adenosina trifosfato (ATP), compreso l'ATP extracellulare (eATP), ha dimostrato di svolgere ruoli significativi in vari aspetti della tumorigenesi, come la resistenza ai farmaci, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e le metastasi. L'eATP intratumorale è da10 3 a10 4 volte superiore in concentrazione rispetto ai tessuti normali. Mentre l'eATP funziona come un messaggero per attivare la segnalazione purinergica per l'induzione EMT, è anche internalizzato dalle cellule tumorali attraverso macropinocitosi sovraregolata, un tipo specifico di endocitosi, per svolgere un'ampia varietà di funzioni biologiche. Queste funzioni includono la fornitura di energia alle reazioni biochimiche che richiedono ATP, la donazione di gruppi fosfato durante la trasduzione del segnale e la facilitazione o l'accelerazione dell'espressione genica come cofattore trascrizionale. L'ATP è prontamente disponibile e il suo studio sul cancro e in altri campi aumenterà senza dubbio. Tuttavia, lo studio eATP rimane in una fase iniziale e le domande irrisolte rimangono senza risposta prima che le attività importanti e versatili svolte dall'eATP e dall'ATP intracellulare interiorizzato possano essere completamente svelate.
I contributi dei laboratori di questi autori a questi primi studi eATP includono l'imaging microscopico di ATP fluorescente non idrolizzabile, accoppiato con dextrans fluorescenti ad alto e basso peso molecolare, che fungono da traccianti di macropinocitosi ed endocitosi, nonché vari inibitori dell'endocitosi, per monitorare e caratterizzare il processo di internalizzazione dell'eATP. Questa modalità di imaging è stata applicata a linee cellulari tumorali e a topi immunodeficienti, xenotrapiantati con tumori tumorali umani, per studiare l'internalizzazione dell'eATP in vitro e in vivo. Questo articolo descrive questi protocolli in vitro e in vivo, con particolare attenzione alla modifica e alla messa a punto delle condizioni di analisi in modo che i saggi di internalizzazione eATP mediati da macropinocitosi / endocitosi possano essere eseguiti con successo in diversi sistemi.

Studio in vitro L'internalizzazione intracellulare di NHF-ATP è stata dimostrata dalla co-localizzazione di NHF-ATP con HMWFD o LMWFD (Figura 4). Il successo di questa procedura si basa principalmente sull'uso di concentrazioni appropriate di NHF-ATP e dextrans e sulla determinazione del tipo o dei tipi appropriati di dextrans (polilisina vs. neutro). Ad esempio, per indagare la macropinocitosi, è stato scelto HMWFD in quanto è internalizzat...

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Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Abbiamo sviluppato un metodo riproducibile per visualizzare l'internalizzazione dell'adenosina trifosfato fluorescente non idrolizzabile (ATP), un surrogato di ATP, ad alta risoluzione cellulare. Abbiamo convalidato il nostro metodo utilizzando saggi indipendenti in vitro e in vivo: linee cellulari tumorali umane e topi immunodeficienti xenografati con tessuto tumorale umano.

Microscopia a fluorescenza per l'internalizzazione dell'ATP mediata dalla macropinocitosi in cellule tumorali umane e topi xenotrapiantati da tumore

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Le cellule tumorali hanno una notevole capacità di internalizzare i nutrienti, come l'ATP, dall'ambiente extracellulare. Il nostro protocollo ci consente di dimostrare l'internalizzazione dell'ATP e di visualizzare la localizzazione dell'ATP all'interno delle cellule. Questa immagine ad alta risoluzione di ATP internalizzato, all'interno di macropinozomi, è ideale per comprendere la localizzazione speciale e completare la quantità di analisi dell'internalizzazione.Il protocollo descrive diverse applicazioni sperimentali per studiare l'internalizzazione dell'ATP. Questo metodo può essere utilizzato per studiare diversi meccanismi di internalizzazione cellulare, tra cui la macropinocitosi e l'endocitosi mediata dagli esosomi. Per le malattie metaboliche, l'internalizzazione dell'ATP nelle cellule non tumorali può essere studiata con questo protocollo.Per iniziare, semina le cellule tumorali in un pallone di 225 centimetri quadrati, contenente DMEM integrato con FBS e antibiotici. Consentire alle cellule di crescere a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica nell'incubatore di colture cellulari. Una volta raggiunta la confluenza dell'80%, staccare le cellule e pellet giù le celle di staccamento mediante centrifugazione e risospesse le celle in PBS ghiacciato per ottenere la densità cellulare di 5 volte 10 alle 6 celle per 100 microlitri di PBS.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pulire il sito di iniezione sul fianco di un topo immunodeficiente, con etanolo al 75%, e pulire l'etanolo in eccesso con una delicata salvietta. Aspirare le cellule in una siringa priva di lattice da un millilitro, dotata di un ago di scorrimento di precisione calibro 27.Per l'iniezione sottocutanea, tenere l'ago con un angolo di circa 10 gradi rispetto alla pelle e inserire la punta dell'ago con la smussatura rivolta verso l'alto sotto la pelle, mantenendo solo uno o due millimetri dell'ago al di fuori della pelle. Erogare le cellule dalla siringa lentamente per circa 10 secondi. Dopo aver iniettato l'intero volume, tenere l'ago in posizione per tre-cinque secondi e quindi prelevare l'ago.Applicare una pressione delicata ma decisa sul sito di iniezione per tre-cinque secondi con le dita, per evitare perdite del contenuto iniettato. Monitorare e misurare la crescita tumorale utilizzando pinze Vernier, fino a quando i tumori raggiungono un volume da 200 a 500 millimetri cubi. Sciogliere 300 microlitri da 16 milligrammi per millilitro destro fluorescente ad alto peso molecolare e DMEM senza siero e incubare a bagnomaria, temperato a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi centrifugare la soluzione di destrano e trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.A 40 microlitri, un ATP fluorescente non idrolizzabile di un millimolare analogo a 160 microlitri di DMEM senza siero, per produrre una soluzione di ATP fluorescente non idrolizzabile da 0,2 millimolari. Preparare le soluzioni di trattamento di DMEM o otto milligrammi per millilitro fluorescente ad alto o basso peso molecolare di destrano, con o senza 100 ATP fluorescente micromolare non idrolizzabile in DMEM, mescolando le soluzioni stock preparate in precedenza. Utilizzare una siringa da un millilitro per raccogliere 50 microlitri di una soluzione di trattamento.Iniettare la soluzione direttamente nel tumore xenotrapianto e ripetere per quattro repliche biologiche di ciascun trattamento. Dopo l'eutanasia del topo e l'isolamento del tessuto tumorale, utilizzare un cucchiaio perforato per raccogliere il tessuto tumorale resecato e posizionare immediatamente il tessuto in un mezzo di congelamento e arrotolare il tessuto, assicurandosi che il tessuto rimanga immerso nei bagni medi, tutte le superfici del tessuto. Posizionare con attenzione il tessuto nello stampo di incorporamento contenente il mezzo di congelamento.Posizionare verticalmente l'etichetta corrispondente nel mezzo di congelamento o nello stampo, assicurandosi che l'etichetta scritta sia visibile all'esterno del supporto. Quando il mezzo di congelamento diventa bianco opaco, rimuovere il blocco di tessuto dallo stampo, posizionare il blocco di tessuto su ghiaccio secco e ripetere il congelamento per ogni sezione tumorale. Conservare i blocchi di tessuto a meno 80 gradi Celsius per diversi mesi prima della procedura di criosezione.Dopo aver fatto le diapositive dei blocchi di tessuto, fissare le diapositive della sezione di tessuto in etanolo al 95% a meno 18 gradi Celsius per cinque minuti. Lavare la sezione fissa con PBS per cinque minuti. Aggiungere da 10 a 50 microlitri di un mezzo di montaggio acquoso con DAPI alle sezioni di tessuto, in base alle dimensioni delle sezioni, e posizionare una copertura di vetro sulla sezione di tessuto.Dopo 12-24 ore di montaggio, identificare le regioni di interesse delle sezioni tumorali fisse e acquisire le immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza come dimostrato in precedenza. Dopo due o 24 ore di fissazione delle cellule tumorali umane e in piedi con DAPI, acquisire le immagini utilizzando un sistema di imaging a epifluorescenza e un software di acquisizione dati. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio a epifiorescenza verticale in modalità binoculare.Apri il programma di imaging, seleziona l'obiettivo 10 volte e regola lo stage per definire la messa a fuoco. Scansiona la diapositiva da sinistra a destra in modo serpentino per identificare le regioni di interesse. Selezionare l'obiettivo 40 volte e utilizzare l'interruttore sul microscopio per passare dalla modalità binoculare a quella di acquisizione dell'immagine.Clicca sull'icona della qualità live per visualizzare e successivamente acquisire le immagini. Utilizzate il pannello OC sulla barra degli strumenti di acquisizione per definire i parametri di esposizione per ogni cubo di filtro o canale fluorescente, quindi utilizzate la barra degli strumenti di acquisizione multicanale per acquisire un'immagine a tre canali con le impostazioni di esposizione definite. In alternativa, le immagini multicanale possono essere acquisite manualmente passando tra i cubi del filtro, impostando il tempo di esposizione, chiudendo o aprendo l'otturatore tra l'acquisizione dell'immagine per ciascun canale e la sovrapposizione di ogni immagine scattata per i singoli canali.Salvare l'immagine come file nd2. Salvare i file TIF, incluse l'immagine del canale unito e le singole immagini del canale. Utilizzare la funzione di conteggio degli oggetti sulla barra degli strumenti annotazioni e misurazioni per contare il numero di celle fluorescenti NHF-ATP, TMR ad alto peso molecolare e TMR fluorescenti a basso peso molecolare su un file di immagine nd2 salvato ed esportare i dati in un foglio di calcolo attraverso il programma di analisi.Questo protocollo è stato sviluppato per l'analisi spaziale, temporale e quantitativa dell'internalizzazione cellulare di ATP non idrolizzabile. L'internalizzazione intracellulare di ATP fluorescente non idrolizzabile è stata dimostrata mediante colocalizzazione di ATP fluorescente non idrolizzabile con destrano fluorescente ad alto o basso peso molecolare in vitro, ex vivo e in vivo. Per garantire che le cellule tumorali conservassero l'ATP interiorizzato, limitato il tempo sperimentale per tutte le iniezioni intratumorali al crio-incorporamento.Tenere conto anche della variazione intratumorale mediante l'imaging del tessuto in tutto il tumore. Le future iterazioni del nostro metodo potrebbero comportare la visualizzazione in tempo reale del processo di internalizzazione dell'E-ATP, rivelando informazioni sulla cinetica macropinocitotica e sul traffico in tessuti specifici.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Rilevamento della progressione del tumore del polmone nei topi mediante Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

FISH per la localizzazione di RNA lungo non codificante in cellule di osteosarcoma umano

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Autore in primo piano: RNA FISH per localizzare lncRNA-SNHG6 nelle cellule di osteosarcoma 

Ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per la localizzazione di RNA non codificante lungo in cellule di osteosarcoma umano

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...