Name: fluorescence microscopy for atp internalization mediated by macropinocytosis in human tumor cells and tumor-xenografted mice
Uploaded: 2021-06-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice at JoVE.com

Kryosectioning ble utført på stedet ved Ohio University Histopathology Core. Dette arbeidet ble delvis støttet av oppstartsfond (Ohio University College of Arts &Sciences) til C Nielsen; NIH gir R15 CA242177-01 og RSAC-prisen til X Chen.

Alle prosedyrer rapportert heri ble utført i samsvar med Ohio Universitys IACUC og med NIH.
1. Valg av ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP (NHF-ATP) og dextrans
<ol><li>Velg en fluorofor-konjugert NHF-ATP (figur 1A) og endokytosesporere, høy og lavmolekylær fluorescerende dextrans (TMR-HMWFD og TMR-LMWFD) (Figur 1B), basert på de foretrukne utslippsbølgelengdene (f.eks. bildebehandlingssystem utstyrt med passende filtre) og d...

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+hallmarks+of+cancer+metabolism.">The emerging hallmarks of cancer metabolism.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Pellegatti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+level+of+extracellular+ATP+at+tumor+sites:+in+vivo+imaging+with+plasma+membrane+luciferase.">Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase.</a> PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).</li><li>Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+adenosine+triphosphate+in+the+pericellular+space.">Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-dependent+anticancer+immune+responses+induced+by+chemotherapeutic+agents+in+mice.">Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice.</a> Science. 334, 1573-1577 (2011).</li><li>Wilhelm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease+is+enhanced+by+extracellular+ATP+activating+P2X7R.">Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R.</a> Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).</li><li>Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Warburg+effect:+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation.">Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Science. 324, 1029-1033 (2009).</li><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).</li><li>Chen, X., Qian, Y., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Warburg+effect:+evolving+interpretations+of+an+established+concept.">The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 79, 253-263 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP,+as+an+energy+and+phosphorylating+molecule,+induces+different+types+of+drug+resistances+in+cancer+cells+through+ATP+internalization+and+intracellular+ATP+level+increase.">Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase.</a> Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).</li><li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+as+a+biological+hydrotrope.">ATP as a biological hydrotrope.</a> Science. 356, 753-756 (2017).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+is+internalized+by+macropinocytosis+and+induces+intracellular+ATP+increase+and+drug+resistance+in+cancer+cells.">Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells.</a> Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).</li><li>Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+a+new+player+in+cancer+metabolism:+NSCLC+cells+internalize+ATP+in+vitro+and+in+vivo+using+multiple+endocytic+mechanisms.">Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms.</a> Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+uptake+via+alpha2+adrenoceptor-mediated+PI3K+activation+following+brief+exposure+to+noradrenaline.">Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline.</a> Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).</li><li>Hoppe, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimalarial+quinolines+and+artemisinin+inhibit+endocytosis+in+Plasmodium+falciparum.">Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents &amp; Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).</li><li>Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+ATP+cross+the+cell+plasma+membrane.">Does ATP cross the cell plasma membrane.</a> Yale Journal of Biology &amp; Medicine. 55, 1-10 (1982).</li><li>Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+utilization+of+extracellular+[gamma-32P]ATP+for+the+phosphorylation+of+intracellular+proteins+in+the+squid+giant+axon.">Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).</li><li>Chaudry, I. H., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+evidence+for+ATP+uptake+by+rat+tissues.">Further evidence for ATP uptake by rat tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).</li><li>Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otto+Warburg's+contributions+to+current+concepts+of+cancer+metabolism.">Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).</li><li>Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Links+between+metabolism+and+cancer.">Links between metabolism and cancer.</a> Genes &amp; Development. 26, 877-890 (2012).</li><li>Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+consumption+promotes+cancer+metabolism.">ATP consumption promotes cancer metabolism.</a> Cell. 143, 669-671 (2010).</li><li>Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+and+insulin+secretion:+the+ATP-sensitive+K++channel+(K+ATP)+connection.">Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection.</a> Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).</li><li>Szendroedi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mitochondrial+ATP+synthesis+and+glucose+transport/phosphorylation+in+type+2+diabetes.">Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes.</a> PLoS Medicine. 4, 154 (2007).</li><li>Miyamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+reveals+elevated+glomerular+ATP/AMP+in+diabetes/obesity+and+identifies+sphingomyelin+as+a+possible+mediator.">Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator.</a> EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).</li></ol>

En metode ble utviklet for romlig, tidsmessig og kvantitativ analyse av cellulær internalisering av ikke-hydroolysert ATP. Denne metoden er bredt anvendelig for bruk i ulike biologiske systemer, inkludert ulike tumorigeniske modeller, som vi gir teknisk instruksjon og representative data for. For å innhente tolkedata under in vivo ATP internaliseringsstudier (paragraf 4 i protokollen), er det viktig å begrense den eksperimentelle tiden som går fra intratumoral dekstraninjeksjon til kryo-innebygging. Å fikse...

Det opportunistiske opptaket av intratumorale ekstracellulære (dvs.) næringsstoffer har nylig blitt kalt et sentralt kjennetegn for kreftmetabolisme1. Et av disse viktige næringsstoffene er ATP, da konsentrasjonen av ieATP er 103 og 104 ganger høyere enn den som finnes i normalt vev, i området flere hundre μM til lav mM2,3,4,5. Som et viktig energi- og signalmolekyl spiller ATP en sentral rolle i cellulær metabolisme i kreft og sunne celler6,7,8. Ekstracellulær ATP er ikke bare involvert i kreftcellevekst, men det fremmer også legemiddelresistens9. Tidligere ukjente funksjoner av ATP, som hydrotropisk aktivitet, har nylig blitt identifisert, og dermed implisert ATP-involvering i sykdommer som Alzheimers10. Faktisk ser det ut til at vår forståelse av ATP og dens funksjoner i kreftceller, sunne celler og andre syke celler er langt fra komplett. På grunn av ATPs ustabilitet og høye omsetningshastigheter i celler er det imidlertid teknisk utfordrende å overvåke ATPs bevegelse over cellemembranen og inn i cellen.
For å løse dette problemet og fylle behovet for dette forskningsområdet, ble det utviklet en metode der ikke-hydroolysert fluorescerende ATP (NHF-ATP) (figur 1) ble brukt som surrogat for å visualisere internaliseringen av ATP og observere den intracellulære romlige lokaliseringen av internalisert ATP, både in vitro og in vivo11,12 . NHF-ATP har vist seg å erstatte endogen ATP for å undersøke ATP-bevegelse på tvers av dyrecellemembraner, både i kreftcellelinjer og i humant tumorvev xenograftert på immunodeficient mus11,12. Videre, administrere makropinocytosehemmere til celler blokkert eATP internalisering, noe som tyder på at intracellulært opptak av eATP innebærer en makropinocytotisk mekanisme9,11,12. Denne protokollen tillater immunobased colabeling mot cellespesifikke proteiner og dermed identifisering av hvilken celletype som internaliserer NHF-ATP. Ved hjelp av in vivo tumor xenografts og høyoppløselig mikroskopi kan NHF-ATP visualiseres romlig over vevsprøven og til og med i en enkelt celle. Disse metodene tillater også kvantitativ analyse, for eksempel prosentandelen av cellulært opptak, antall makropinocytotiske vesikler og internaliseringskinetikk. Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan NHF-ATP, som arbeider alene eller sammen med endokytose-tracer fluorescerende dextrans13,14,15,16, kan brukes i forskjellige eksperimentelle omgivelser for å studere ATPs internalisering og intracellulær lokalisering, etter internalisering i celler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62768/62768fig01.jpg"> Figur 1: Strukturer av ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP og tetrametylrhodamin merket høymolekylær fluorescerende dextran. (A) Struktur av NHF-ATP. (B) Skjematisk representasjon av HMWFD. Forkortelser: ATP = adenosin tripfosfat; NHF-ATP = ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP; TMR = tetrametylrhodamin; HMWFD = fluorescerende dekstran med høy molekylvekt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62768/62768fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A549 cells, human lung epithelial, carcinoma</td>
			<td>National Cancer Institute</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Less expensive source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, Reynolds</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6CHG6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP analog</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NK-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave, sterilizer</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>33ZZ40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades, cryostat, high profile</td>
			<td>C. L. Sturkey, Inc.</td>
			<td>DT554550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers, vernier</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4KU77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium, Ham&#39;s Nutrient Mixture F12, serum-free</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51651C-1000ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423555000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 12 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat, Leica CM1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipe, Kim Wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>MW = 70,000, Tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Local delivery</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #7, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (small, medium, large)</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>N191, N192, N193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-046-563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF16034F EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, cell culture</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labelling tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pen, Sharpie (ultra-fine)</td>
			<td>Staples</td>
			<td>642736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, immunodeficient (Nu/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge, accuSpin Micro17</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-4983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 27 gauge</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>752 0071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>39AL12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Staples</td>
			<td>33550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>416785000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (200 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets, serological (10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippetor, Gilson P2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF9930A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 &#956;L, 20-200 &#956;L, 200-1000 &#956;L)</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF9931A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform shaker - orbital, benchtop</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-51710-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides, Superfrost</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, surgical - sharp, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14005-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for image analysis, Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for image analysis, ImageJ (FIJI)</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Download online (free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047740044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tray, 245 mm BioAssay Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 cc</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, laboratory, 19 mm width</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-5R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask, 225 cm2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24-well</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold, stainless steel</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, Precision GP 2S</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>TSGP2S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy for atp internalization mediated by macropinocytosis in human tumor cells and tumor-xenografted mice

Adenosin tripfosfat (ATP), inkludert ekstracellulær ATP (eATP), har vist seg å spille betydelige roller i ulike aspekter av tumorigenesis, som narkotikaresistens, epitel-mesenchymal overgang (EMT) og metastase. Intratumoral eATP er 103 til 104 ganger høyere i konsentrasjon enn i normalt vev. Mens eATP fungerer som en budbringer for å aktivere purinergisk signalering for EMT-induksjon, er den også internalisert av kreftceller gjennom upregulert makropinocytose, en bestemt type endokytose, for å utføre et bredt spekter av biologiske funksjoner. Disse funksjonene inkluderer å gi energi til ATP-krevende biokjemiske reaksjoner, donere fosfatgrupper under signaltransduksjon, og legge til rette for eller akselerere genuttrykk som transkripsjonell kofaktor. ATP er lett tilgjengelig, og studien på kreft og andre felt vil utvilsomt øke. Imidlertid forblir eATP-studien på et tidlig stadium, og uløste spørsmål forblir ubesvart før de viktige og allsidige aktivitetene som spilles av eATP og internalisert intracellulær ATP kan løses helt.
Disse forfatternes laboratoriers bidrag til disse tidlige eATP-studiene inkluderer mikroskopisk avbildning av ikke-hydrolysbar fluorescerende ATP, kombinert med høy- og lavmolekylære fluorescerende dextrans, som fungerer som makropinocytose og endokytosesporere, samt ulike endokytosehemmere, for å overvåke og karakterisere eATP-internaliseringsprosessen. Denne avbildningsmodaliteten ble brukt på tumorcellelinjer og på immunodeficient mus, xenografted med menneskelige kreftsvulster, for å studere eATP internalisering in vitro og in vivo. Dette dokumentet beskriver disse in vitro- og in vivo-protokollene, med vekt på å endre og finjustere analyseforhold slik at makropinocytose-/endokytosemediert eATP internaliseringsanalyser kan utføres i forskjellige systemer.

In vitro-studie Intracellulær internalisering av NHF-ATP ble demonstrert ved samlokalisering av NHF-ATP med HMWFD eller LMWFD (figur 4). Suksessen til denne prosedyren er først og fremst avhengig av bruk av passende konsentrasjoner av NHF-ATP og dextrans og på å bestemme riktig type dextrans (polylyin vs. nøytral). For å undersøke makropinocytose ble for eksempel HMWFD valgt da den bare internaliseres av makropinosomene...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice at JoVE.com

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Vi utviklet en reproduserbar metode for å visualisere internaliseringen av ikke-hydroolyzable fluorescerende adenosin triphosfat (ATP), en ATP surrogat, med høy cellulær oppløsning. Vi validerte metoden vår ved hjelp av uavhengige in vitro- og in vivo-analyser-menneskelige tumorcellelinjer og immunodeficient mus xenografted med humant tumorvev.

Fluorescensmikroskopi for ATP Internalisering mediert av makropinocytose i humane tumorceller og tumor-xenograftede mus

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Kreftceller har en bemerkelsesverdig evne til å internalisere næringsstoffer, for eksempel ATP, fra det ekstracellulære miljøet. Vår protokoll tillater oss å demonstrere ATP internalisering og visualisere ATP lokalisering i celler. Denne høyoppløselige avbildningen av internalisert ATP, innen makropynozomer, er ideell for å forstå especial lokalisering og fullføre mengde analyse av internalisering.Protokollen beskriver ulike eksperimentelle anvendelser for å studere ATP internalisering. Denne metoden kan brukes til å studere ulike mekanismer for cellulær internalisering, inkludert makropinocytose og eksosommediert endokytose. For metabolske sykdommer kan ATP-internalisering i ikke-kreftceller studeres med denne protokollen.Til å begynne med frø kreftcellene i en 225 kvadratcentimeter kolbe, som inneholder DMEM supplert med FBS og antibiotika. La cellene vokse ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i cellekulturinkubatoren. Når 80% sammenløpet er oppnådd, løsne cellene og pellet ned løsne cellene ved sentrifugering, og resuspend cellene i iskald PBS for å oppnå celletettheten på 5 ganger 10 til 6 celler per 100 mikroliter AV PBS.Overfør cellefjæringen til et mikrosenterrør på 1,5 milliliter. Rengjør injeksjonsstedet på flanken av en immunodeficient mus, med 75% etanol, og tørk overflødig etanol med en delikat oppgaveserviett. Trekk cellene inn i en en milliliter lateksfri sprøyte, utstyrt med en 27 gauge presisjonsglide nål.For subkutan injeksjon, hold nålen i ca 10 graders vinkel mot huden og sett inn nålespissen med skråkanten vendt opp under huden, og hold bare en til to millimeter nålen utenfor huden. Dispenser cellene fra sprøyten langsomt over ca. 10 sekunder. Etter å ha injisert hele volumet, hold nålen på plass i tre til fem sekunder og trekk deretter nålen.Påfør forsiktig, men fast trykk på injeksjonsstedet i tre til fem sekunder med fingrene, for å forhindre lekkasje av det injiserte innholdet. Overvåk og mål tumorveksten ved hjelp av Vernier-kalipere, til svulstene når et volum på 200 til 500 kubikkmillimeter. Løs opp 300 mikroliter med 16 milligram per milliliter høymolekylær fluorescerende dekstran og serumfri DMEM, og inkuber i et vannbad, herdet ved 37 grader Celsius i 30 minutter, sentrifuger deretter dekstranoppløsningen og overfør supernatanten til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Ved 40 mikroliter, en en millimolar ikke hydrolyserbar fluorescerende ATP analog lager til 160 mikroliter serumfri DMEM, for å lage en 0,2 millimolar ikke-hydroolysert fluorescerende ATP-løsning. Forbered behandlingsløsningene til DMEM eller åtte milligram per milliliters høye eller lave molekylvekt fluorescerende dextran, med eller uten 100 mikromolar ikke-hydroolysert fluorescerende ATP i DMEM, ved å blande lagerløsningene som er utarbeidet tidligere. Bruk en en milliliter sprøyte for å samle 50 mikroliter av en behandlingsløsning.Injiser løsningen direkte i xenograftsvulsten og gjenta for fire biologiske replikeringer av hver behandling. Etter å ha euthanizing musen og isolerer tumorvevet, bruk en perforert skje for å øse opp det resected tumorvevet og umiddelbart plassere vevet i et frysende medium og rulle vevet, og sørg for at vevet forblir nedsenket i middels bad, alle vevsflatene. Plasser vevet forsiktig i innbyggingsformen som inneholder frysemediet.Plasser den tilsvarende etikettkoden vertikalt i frysemediet eller formen, slik at den skrevne etiketten er synlig utenfor mediet. Når frysemediet blir ugjennomsiktig hvitt, fjern vevsblokken fra formen, plasser vevsblokken på tørris og gjenta frysing for hver tumorseksjon. Oppbevar vevsblokkene ved minus 80 grader Celsius i flere måneder før kryoseksjonsprosedyren.Etter å ha gjort lysbildene på vevsblokkene, fest vevsseksjonen glir i 95% etanol ved minus 18 grader Celsius i fem minutter. Vask den faste delen med PBS i fem minutter. Tilsett 10 til 50 mikroliter av et vandig monteringsmedium med DAPI i vevsseksjonene, i henhold til størrelsen på seksjonene, og legg et glassdeksel over vevsdelen.Etter 12 til 24 timers montering, identifiser områder av interesse for de faste tumordelene og skaff bildene ved hjelp av fluorescensmikroskopi som vist tidligere. Etter to til 24 timer med den menneskelige tumorcellefikseringen og stående med DAPI, ta bildene ved hjelp av et epifluorescence bildebehandlingssystem og datainnsamlingsprogramvare. Plasser lysbildet på scenen til et oppreist epiflorescensmikroskop i kikkertmodus.Åpne bildebehandlingsprogrammet, velg målsettingen 10 ganger og juster stadiet for å definere fokus. Skann lysbildet fra venstre mot høyre på en serpentinsk måte for å identifisere interesseområdene. Velg 40 ganger objektivet, og bruk veksleknappen på mikroskopet til å bytte fra kikkert til bildeopptaksmodus.Klikk på ikonet for live kvalitet for å se og deretter skaffe bildene. Bruk OC-panelet på anskaffelsesverktøylinjen til å definere eksponeringsparameterne for hver filterkube eller fluorescerende kanal, og bruk deretter verktøylinjen for flerkanalsanskaffelse til å skaffe et trekanalsbilde med de definerte eksponeringsinnstillingene. Alternativt kan flerkanalsbilder hentes manuelt ved å veksle mellom filterkubene, angi eksponeringstid, lukke eller åpne lukkeren mellom bildeanskaffelse for hver kanal og legge over hvert bilde som er tatt for individuelle kanaler.Lagre bildet som nd2-fil. Lagre TIF-filene, inkludert det sammenslåtte kanalbildet og individuelle kanalbilder. Bruk objekttellingsfunksjonen på verktøylinjen for merknader og målinger til å telle antall NHF-ATP-, TMR-fluorescerende dekstran- og TMR-fluorescerende dekstranpositive celler med høy molekylvekt på en lagret nd2-bildefil og eksporter dataene til et regneark gjennom analyseprogrammet.Denne protokollen ble utviklet for romlig, tidsmessig og kvantitativ analyse av cellulær internalisering av ikke-hydroolysert ATP. Den intracellulære internaliseringen av ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP ble demonstrert ved colokalisering av ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP med høy eller lav molekylvekt fluorescerende dextran in vitro, ex vivo og in vivo. For å sikre at tumorceller beholdt internalisert ATP, begrenset eksperimentell tid for all intratumoral injeksjon til kryo-innebygging.Også gjøre rede for intratumoral variasjon ved å avbilde vev gjennom hele svulsten. Fremtidige gjentakelser av metoden vår kan innebære sanntidsvisualisering av E-ATP-internaliseringsprosessen, avsløre informasjon om makropynocytotisk kinetikk og menneskehandel i bestemte vev.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal vaksinasjon av Squamous celle Carcinoma celler i mus for svulst immun profilering og behandling respons vurdering

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Påvisning av lungetumorprogresjon hos mus ved ultralydavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantasjon for å vurdere dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler hos mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenisitet Screening av tumor-avledede ekstracellulære vesicles av Flow Cytometry av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

FISH for lang ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Forfatter Spotlight: RNA FISH for lokalisering av lncRNA-SNHG6 i osteosarkomceller 

RNA-fluorescens in situ-hybridisering for lang, ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...