Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
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लेखक उपयोगी सलाह के लिए थर्मो फिशर साइंटिफिक के डॉ हर्वे रेमिगी को धन्यवाद देते हैं। क्रायो-ईएम प्रयोगएकडेमिया सिनिका क्रायो-ईएम सुविधा (एएससीईएम) में किए गए थे। ASCEM एकेडेमिया सिनिका (ग्रांट नंबर 1) द्वारा समर्थित है। एएस-सीएफआईआई-108-110) और ताइवान प्रोटीन प्रोजेक्ट (अनुदान सं। एएस-केपीक्यू-109-टीपीपी 2)। लेखकों ने नमूना तैयारी के साथ सहायता के लिए सुश्री हुई-जू हुआंग को भी धन्यवाद दिया।

नोट: इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विशिष्ट तापमान पर क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) नमूने तैयार करने के लिए एक संशोधित वाणिज्यिक विट्रीफिकेशन उपकरण का उपयोग करना है, विशेष रूप से 37 डिग्री से?...

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	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

प्रोटोकॉल के चरण 1 में, सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज ट्यूब अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और प्रयोग प्रगति पर होने पर नहीं गिरता है। कक्ष में बड़ी संख्या में पानी की बूंदों के संचय के कारण, जो फिल्टर ...

प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को हल करने के लिए क्रायो-ईएम तकनीक में सुधार जारी है, विशेष रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को प्राप्त करने की दिशा में 1,2। इस बीच, इसके आवेदन के परिदृश्य को विटिफिकेशन प्रक्रिया3 से पहले पीएच या लिगेंड जैसी नमूना स्थितियों को बदलकर विस्तारित किया गया है, जिसमें नमूना ग्रिड की तैयारी शामिल है, जिसके बाद फ्रीजिंग 4,5 है। एक और महत्वपूर्ण स्थिति तापमान है। यद्यपि क्रायो-ईएम प्रयोग, जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, कम तापमान पर किए जाते हैं, क्रायो-ईएम द्वारा हल की गई संरचना विट्रीफिकेशन से पहले समाधान अवस्था में संरचना को दर्शाती है। हाल ही में, अधिकांश एकल कण विश्लेषण (एसपीए) क्रायो-ईएम अध्ययन उन नमूनों का उपयोग करते हैं जो विट्रीफिकेशन6 से पहले बर्फ (यानी, 4 डिग्री सेल्सियस पर) पर रखे जाते हैं, हालांकि कई अध्ययन कमरे के तापमान 7,8,9,10 या 42 डिग्री सेल्सियस 11 के आसपास नमूनों का उपयोग करते हैं। हाल की एक रिपोर्ट में, हमने थर्मोफिलिक आर्कियन सल्फोलोबस सोलफैटारिकस (एसएसओ) से एंजाइम केटोल-एसिड रिडक्टोइसोमेरेज़ (केआरआई) के तापमान-निर्भर अध्ययन 4 डिग्री सेल्सियस से 70 डिग्री सेल्सियस12 तक छह अलग-अलग तापमानों पर किए। हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करना महत्वपूर्ण है और क्रायो-ईएम एकमात्र संरचनात्मक विधि है जो कई तापमानों पर एक ही प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए व्यावहारिक रूप से संभव है।
उच्च तापमान पर विट्रीफिकेशन के लिए प्रमुख कठिनाई वाष्प संघनन को कम करना और पतली बर्फ प्राप्त करना है। यहां हम एसएसओ-केआरआई 12 के हमारे पिछले अध्ययन में उच्च तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। हम मानते हैं कि पाठक या दर्शक पहले से ही क्रायो-ईएम प्रयोगों के लिए समग्र नमूना तैयारी और डेटा प्रोसेसिंग प्रक्रियाओं में अनुभवी हैं और उच्च तापमान से संबंधित पहलुओं पर जोर देते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) प्रयोगों के लिए नमूना ग्रिड आमतौर पर जैविक नमूनों के भंडारण के लिए इष्टतम तापमान पर तैयार किए जाते हैं, ज्यादातर 4 डिग्री सेल्सियस पर और कभी-कभी कमरे के तापमान पर। हाल ही में, हमने पाया कि कम तापमान पर हल की गई प्रोटीन संरचना कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक नहीं हो सकती है, खासकर थर्मोफिलिक आर्किया से प्रोटीन के लिए। क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए उच्च तापमान (70 डिग्री सेल्सियस तक) पर प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई थी। हमने दिखाया कि उच्च तापमान पर तैयार किए गए नमूनों से संरचनाएं कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक और तापमान पर निर्भर हैं। यहां हम एक उदाहरण के रूप में 55 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके उच्च तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रयोग ने एक अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके संशोधित एक विट्रीफिकेशन उपकरण का उपयोग किया, और नमूने 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए गए। वाष्प संघनन को कम करने और ग्रिड पर बर्फ की एक पतली परत प्राप्त करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को ठीक किया गया था। सफल और असफल प्रयोगों के उदाहरण प्रदान किए गए हैं।

कम आवर्धन अवलोकन चित्रा 5 ए, बी में दिखाया गया है। पैनल ए एक सफल ग्रिड का एक उदाहरण है। ऊपर बाईं ओर (मोटी) से नीचे दाईं ओर (पतला या खाली) एक बर्फ ढाल है। इस तरह के ग्रिड से डेटा संग्रह के लिए उ...

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Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

यह पेपर क्रायो-ईएम प्रयोगों के लिए ठंड से पहले, 70 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

प्रोटीन के कार्य तापमान पर निर्भर होते हैं और तापमान पर इष्टतम होते हैं। यह प्रोटोकॉल उच्च तापमान पर प्रोटीन संरचनाओं को हल करने का एक तरीका प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक संरचनाएं प्रदान कर सकता है और प्रोटीन संरचनाओं की तापमान निर्भरता की समझ को बढ़ा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन एकेडेमिया सिनिका क्रायो ईएम सुविधा के प्रबंधक युआन-चिह चांग करेंगे। इसके बंद छोर पर 50 मिलीमीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक सेंटीमीटर छेद बनाकर शुरू करें। अल्ट्रासोनिक पानी के आउटलेट पर विटिफिकेशन तंत्र कक्ष में ट्यूब रखें।विट्रीफिकेशन उपकरण के तापमान को निर्दिष्ट तापमान पर सेट करें, और विटिफिकेशन उपकरण कक्ष को 55 डिग्री सेल्सियस और 100% सापेक्ष आर्द्रता तक पहुंचने की अनुमति दें। प्रयोग शुरू करने से पहले स्थितियों को स्थिर करने के लिए इसे कम से कम आधे घंटे तक खड़े रहने दें। एक गर्म प्लेट पर पानी स्नान रखें और गर्म प्लेट को वांछित तापमान पर सेट करें।यह सुनिश्चित करने के लिए थर्मामीटर से जांचें कि पानी 55 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है। पानी के स्नान में नमूने को इनक्यूबेट करें, और सोख्ता प्रयोग से पहले गर्म प्लेट के किनारे पर पिपेट टिप को दो मिनट या उससे अधिक समय के लिए प्रीहीट करें। ग्लो डिस्चार्ज 30 सेकंड के लिए 25 मिलीमीटर पर एक छिद्रित कार्बन समर्थित ग्रिड है।ब्लॉटिंग प्रयोग से पांच मिनट पहले विट्रीफिकेशन फिल्टर पेपर को विटिफिकेशन उपकरण कक्ष में रखें। चिमटी को दो मिनट या उससे अधिक समय के लिए विट्रीफिकेशन उपकरण में ग्रिड के साथ इनक्यूबेट करें। मानक प्रक्रियाओं के अनुसार ईथेन के साथ ईथेन कंटेनर का निर्माण करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ईथेन अतिप्रवाह नहीं करता है।ग्रिड पर नमूने के सात से नौ माइक्रोलीटर लागू करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। फिर एक से दो सेकंड तक प्रतीक्षा करें, एक से डेढ़ सेकंड के लिए धब्बा लगाएं, और जल्दी से नमूने को तरल ईथेन में डुबो दें। तरल ईथेन से तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत क्रायो बॉक्स में ग्रिड को स्थानांतरित करें।ग्रिड को क्लिप करें और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप या क्रायो ईएम उपकरण प्राप्त करने के लिए उन्हें अनलोड करें। ग्रिड पर बर्फ की स्थिति और ग्रिड पर नमूने के वितरण को स्क्रीन करने के लिए क्रायो ईएम उपकरण की डिस्प्ले स्क्रीन और सॉफ्टवेयर के कम खुराक फ़ंक्शन का उपयोग करें। यदि परिणामी ग्रिड की गुणवत्ता अच्छी नहीं है, तो प्रतीक्षा समय, सोख्ता समय आदि जैसी विभिन्न स्थितियों के साथ ग्रिड तैयारी की प्रक्रिया को दोहराएं।यदि परिणामी ग्रिड की गुणवत्ता अच्छी है, तो एक अलग तापमान पर ग्रिड बनाने के लिए समान चरणों को दोहराएं। अच्छी गुणवत्ता वाले ग्रिड को एक उच्च रिज़ॉल्यूशन क्रायो ईएम उपकरण में स्थानांतरित करें। स्थापित प्रक्रियाओं के अनुसार डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण करें।सफल ग्रिड के मामले में, ग्रिड के शीर्ष बाईं ओर मोटी बर्फ और नीचे दाईं ओर पतली बर्फ के साथ एक बर्फ ढाल बनती है। सफल ग्रिड में डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त नीले और हरे रंग के बक्से देखे गए। दूसरे ग्रिड में एक उज्ज्वल विरोधाभास देखा गया था।बर्फ की एक पतली परत या बर्फ की अनुपस्थिति का संकेत। दूसरे ग्रिड में डेटा संग्रह के लिए केवल दो वर्ग उपयुक्त पाए गए। ग्रिड में से एक में ज्यादातर क्रिस्टलीन रूप में बर्फ शामिल थी, जो डेटा संग्रह के लिए अनुपयुक्त थी।दूसरी ओर, अन्य ग्रिड से पता चला कि बर्फ की परत ज्यादातर डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त अनाकार अवस्था में थी। कंटेनर और अन्य के रूप में तैयारी को एक समय बिंदु के अनुसार पूरा करने की आवश्यकता है। समय नियंत्रण और प्रयोग को जल्दी और सटीक रूप से समाप्त करना सबसे महत्वपूर्ण है।इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के आधार पर, शोधकर्ता को सरल स्थितियों को स्थापित करने में अधिक सावधान रहना पड़ सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

प्रोटेओमिक्स सुविधा सबमिशन और बाद के डेटा विश्लेषण के लिए टीएमटी नमूना तैयारी

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

क्रायो-ईएम और Scipion के साथ एकल कण विश्लेषण

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट का नियमित संग्रह

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

पील-ब्लोट तकनीक: बहु-स्तरित या केंद्रित जैविक नमूनों से एकल परतों को अलग करने के लिए एक क्रायो-ईएम नमूना तैयारी विधि

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

लेगिनन का उपयोग करके स्टेज टिल्ट के साथ सिंगल-पार्टिकल क्रायो-ईएम डेटा संग्रह

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए मोनोलेयर ग्राफीन का अनुप्रयोग

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...