Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

نشكر ماري سانشيز على العناية الممتازة بالحيوانات. ويدعم أبحاث المؤلفين المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH/NICHD) منح R01HD067473-08 وR21 HD102668-01 والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK/NIH) منحة R01DK128068-01.

جميع الإجراءات المذكورة معتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة يوتا. يتم إيواء الضفادع في منشأة معتمدة من IACUC. يتم قتل الضفادع الذكور عن طريق الانغماس في tricaine التالية عن طريق قص البطين من القلب. يتم إيواء الضفادع الإناث في المختبر لمدة أقصاها 24 ساعة بعد التعري?...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

المزايا الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا هي أنه يمكن إكماله بسرعة نسبية ، ولا يتطلب كاشفات باهظة الثمن ويوفر مصدرا لمنتجات شق Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية. ميزة أخرى هي أنه يسمح للمرء بتحليل البروتينات الموسومة epitope وبالتالي التحايل على نقص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا التي تعترف مع...

يتم تصنيع أعضاء عامل النمو التحويلي ß (Tgfß) بشكل فائق كبروتينات سلائف غير نشطة وخافتة. ثم يتم شق السلائف من قبل أعضاء عائلة تحويل البربروتين (PC) ، إما داخل المسار الافرازي أو خارج الخلايا. وهذا يخلق نشطة، disulfide المستعبدين ليغند ديمر واثنين من شظايا prodomain1. على الرغم من أنه كان معروفا لأكثر من 30 عاما أن مطلوب من السلائف الأسرة Tgfß لتوليد ليغاند نشط2, فهم كيفية prodomains المساهمة في وظيفة ليغاند غير مكتملة.
على الرغم من أن فهم عملية التنشيط البروتيوليكي لأفراد عائلة Tgfß لا يزال غير مكتمل ، إلا أن هناك اهتماما متزايدا بفهم أي عزر توافق PC (ق) مشقوق في الجسم الحي، وما إذا كان الانقسام يحدث في مقصورة فرعية أو خارج الخلية محددة ، وما إذا كان المجال الأساسي لا يزال مرتبطا بشكل متناقض أو غير متناقض مع الليغندالمشقوق 3. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن prodomain ليس فقط أدلة ليغاند للطي قبل الانقسام4,5, ولكن يمكن أيضا التأثير على استقرار عامل النمو ومجموعة من العمل6,7,8,9, محرك تشكيل homodimers أو heterodimers10, مرساة ليغاند في مصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الكمون ليغاند11, وفي بعض الحالات, وظيفة باعتبارها ليغاند في حد ذاتها لتنشيط heterologous إشارة12. وترتبط الطفرات نقطة Heterozygous داخل نطاق العديد من أفراد الأسرة Tgfß مع العين والعظام والكلى والهيكل العظمي أو غيرها من العيوب في البشر3. تسلط هذه النتائج الضوء على الدور الحاسم للبروتودمين في توليد والحفاظ على ليغاند نشط وتشدد على أهمية تحديد وفك شفرة دور منتجات الانقسام التي تم تطويرها أثناء النضج البروتيوليكي للسلائف العائلية Tgfß.
هنا نصف بروتوكول مفصل لمنتجات شق القرصنة المتولدة أثناء نضوج السلائف الأسرة Tgfß من blastocoele من الأجنة X. laevis ومن ثم تحليلها على الخلايا المناعية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من عزر توافق الآراء PC (ق) في بروتين السلائف هي مشقوق في الجسم الحي10،13، وتحديد PC الذاتية (ق) التي تلتصق كل عزر13،1 14، قارن في تشكيل الجسم الحي من المثليات الأسرة Tgfß مقابل heterodimers10 أو تحليل ما إذا كانت الطفرات نقطة المرتبطة بالأمراض البشرية في السلائف Tgfß تؤثر على قدرتها على تشكيل ليغاندس ثنائية الأبعاد وظيفية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

الذراعين من عامل النمو تحويل ß (Tgfß) superfamily، ممثلة Tgfß / العقدة أو العظام البروتين المورفوجيني (Bmp) ليغاندس، على التوالي، تلعب أدوارا أساسية في التنمية الجنينية وهوس العظام الكبار. يتم إجراء أعضاء الأسرة Tgfß والسلائف غير نشطة أن تتناقص وأضعاف داخل الشبكية endoplasmic. يتم شق السلائف في وقت لاحق إلى شظايا ليغاند وبروتدومين. على الرغم من أن فقط ليغاند ثنائية يمكن إشراك مستقبلات Tgfß وتفعيل الإشارات المصب، وهناك اعتراف متزايد بأن moiety prodomain يساهم في النشاط ليغاند. توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن استخدامه لتحديد منتجات الانقسام التي تم إنشاؤها أثناء تنشيط بروتينات السلائف Tgfß. يتم أولا حقن سلائف ترميز RNA Tgfß في أجنة X. laevis. في اليوم التالي ، يتم جمع منتجات الانقسام من blastocoele من أجنة مرحلة gastrula وتحليلها على البقع الغربية. يمكن إكمال هذا البروتوكول بسرعة نسبيا، لا يتطلب الكواشف باهظة الثمن ويوفر مصدرا للمنتجات الانقسام Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية.

كان هدف التجربة الموصوف أدناه هو تحديد ما إذا كان Bmp4 و Bmp7 يشكلان heterodimers (dimers يتكون من Bmp4 ligand واحد و Bmp7 ligand) ، homodimers (يتكون من Bmp4 أو اثنين من Bmp7 ligands) ، أو مزيج من كل عندما يتم التعبير عنها في X. laevis. يتم استخراج البيانات المعروضة في الشكل 2 من دراسة نشرت سابقا10. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

عند تحويل عامل النمو ß البروتينات السلائف الأسرة يتم التعبير عنها خارج الرحم في الأجنة Laevis Xenopus، فإنها تغمغم، والحصول على مشقوق وتفرز في blastocoele، الذي يبدأ في وقت متأخر blastula إلى مرحلة gastrula في وقت مبكر. نحن نصف طريقة لاستنشق منتجات الانقسام من تجويف الانفجار لتحليل المناعة.

تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العملية التي يتم من خلالها تحويل مجموعة أوسع من بروتينات السلائف المنفصلة ، بما في ذلك أفراد عائلة TGF-beta ، إلى بروتينات نشطة بعد الانقسام البروتيوليكي. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يوفر أساليب سريعة جدا وغير مكلفة للحصول على المنتج TGF بيتا الانقسام عالية التركيز في الجسم الحي في ظل حالة تصور. في البداية ، بعد الحقن في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول Ficoll وأي أجنة ميتة أو تحتضر ، ثم شطف الأجنة مرة أو مرتين مع MBS وزراعة الأجنة في MBS على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة أو عند 16 درجة مئوية في الحاضنة لإبطاء التطور.الحرارة وسحب الشعيرات الدموية الزجاج إلى نقطة غرامة باستخدام سحب micropipette مع الإعدادات المطلوبة. باستخدام ملقط، مقطع قبالة غيض من إبرة سحبت. لمنع انسداد, يجب أن يكون فتح إبرة طموح blastocele أكبر من إبرة microinjection.أدخل إبرة الشفط في حامل الإبرة المتصل بالمزلق الدقيق واربط حامل الإبرة بالميكرومانيبواتور. ضع أجنة مرحلة الغازترولا في وقت مبكر إلى منتصفها في صينية حقن مملوءة ب MBS أو طبق. أدخل الإبرة أسفل سطح الجنين بالقرب من القطب الحيواني.اضغط على زر التعبئة على المحقن الدقيق أثناء مراقبة الإبرة والجنين من خلال مجهر تشريح. على مدى بضع ثوان ، يرتفع مستوى السائل الواضح في الإبرة وينهار الجنين ويصبح مقعرا. نبض زر الحقن مرة واحدة أو أكثر لإخراج أي مادة بيضاء غائمة تدخل الإبرة التي تحتوي على الحطام أو proteases.للكشف عن المنتجات الانقسام على مناعة، يستنشق السائل الكيسي من 10 إلى 20 جنينا أو أكثر اعتمادا على الأجسام المضادة. ماصة واحدة ميكرولتر من الماء الخالي من النواة على قطعة البارافين وضعت على صينية الحقن. غمر الإبرة في قطرة الماء واضغط على زر الحقن لتبديل سائل الكيسة الأريمية في الماء.بدلا من ذلك، لإخراج السائل مباشرة على البارافيلم ومنعه من تسطيح بها، نبض زر الحقن لطرد السائل تحت ضغط أقل. نقل السائل blastocele حصادها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق العقيمة على الجليد وإضافة المياه الخالية من النواة لضبط حجم النهائي إلى 30 ميكرولتر. للكشف عن بروتينات السلائف TGF-beta، قم بنقل أجنة سائل الكيسة الأريمية المستنفدة إلى أنبوب منفصل على الجليد.إزالة MBS الزائدة وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة قبل lysate الجنين المبردة. لتجانس الأجنة بشكل كامل، ماصة صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرة حتى لا تبقى كتل. الطرد المركزي الأجنة المتجانسة في جهاز الطرد المركزي المبردة في 10،000 مرة G لمدة 10 دقائق، ثم إزالة 160 ميكرولتر من supernatant باستخدام ماصة P200 ونقلها إلى أنبوب جديد على الجليد، مع الحرص على تجنب بروتينات صفار البيض وغيرها من الحطام الخلوي في النصف السفلي من الأنبوب.كرر الطرد المركزي الدقيق مرة واحدة ونقل 128 ميكرولتر من الفائقة واضحة إلى أنبوب جديد على الجليد. عند هذه النقطة، يمكن تخزين lysates الأجنة تطهيرها والسوائل blastocele التي تم جمعها في ناقص 80 درجة مئوية لطالما رغبت في ذلك. Deglycosylate البروتينات المشقوقة الموجودة في سائل الكيسة الأريمية المعدلة من خلال شبكة ترانس غولجي مع PNGase F باتباع تعليمات الشركة المصنعة.وهاجر المنتجات deglycosylated كشريط أكثر كثافة على المواد الهلامية SDS، والتي يمكن أن تساعد في تحديد دقيق. لتقييم مونومرات جزء البرودمين والبروتينات التي تكشفت في blastocele وlysate، وتحليل البروتينات في ظل ظروف الحد من خلال إضافة خمسة ميكرولترات من الحد من العازلة عينة 4X إلى 15 ميكروليتر سائل الكيسة الأريمية و 15 ميكرولتر من lysate الجنين أوضح. لتقييم تشكيل المشقوقات المشقوقة أو الليجانات الهتيريوديميرية في الأريميوسيلي ، قم بتحليل البروتينات في ظل ظروف غير متناقصة عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من العازلة عينة 4X غير المخفضة إلى ال 15 ميكرولتر المتبقية من سائل الأريميوكل ، ثم تسخينها لمدة خمس دقائق ووضعها على الجليد.بعد استخدام هذا البروتوكول ، تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE وتم فحص الأجسام المناعية مع الأجسام المضادة التي تعرفت على علامة epitope myc. في ظل ظروف التخفيض ، في الليسات من الأجنة التي تعبر فقط عن Bmp4 أو Bmp7 ، تم اكتشاف نطاق واحد مقابل مونومر Bmp4 المشقوق و نطاق مهاجر أبطأ مقابل مونومرات Bmp7 المشقوقة. تم الكشف عن كلا النطاقين في الأجنة التي تشارك في التعبير عن Bmp4 و Bmp7.عندما تم فصل البروتينات في ظل ظروف غير الحد، تم الكشف عن Bmp4 ناضجة واحدة و 7 نطاق heterodimer من التنقل المتوسط جنبا إلى جنب مع كمية ضئيلة من homodimer Bmp4 في الأجنة المشاركة في التعبير عن Bmp4 وBmp7. لوحظ أيضا تشكيل الهتروديمر Bmp4 وBmp7 عندما كانت مستويات البروتين Bmp7 عالية. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، شكلت Bmp7 الزائدة التجانس والأجنة التي أعرب عنها المشترك Bmp4 و Bmp7.وأظهرت هذه النتائج أن Bmp4 و 7 شكل تفضيلي heterodimers عندما أعرب المشتركة في الأجنة Laevis Xenopus. في هذه التجربة، وجمع blastocele نقية هي الخطوة الأكثر أهمية التي تتطلب تجربة التعامل مع إبرة دقيقة. لذا استمر في المحاولة وإصلاح الأخطاء.هذا الإجراء اختبارات ما إذا كان شكل الهيروديمير BMP والأحماض الأمينية التي هي مهمة لهذا الغرض. الخطوة التالية، يمكن أن تتولد الماوس knockin أن نسأل ما إذا كانت هذه الأحماض الأمينية مهمة وظيفيا أثناء تطور الثدييات.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

لقطة على نطاق الجينوم من المنظمين لونين والدول في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق رقاقة تسلسل

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...