Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Vi takker Mary Sanchez for fremragende dyrepleje. Forfatternes forskning støttes af National Institute of Child Health and Human Development of National Institutes of Health (NIH/NICHD) tilskud R01HD067473-08 og R21 HD102668-01 og af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK/NIH) tilskud R01DK128068-01.

Alle beskrevne procedurer er godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Anvendelse (IACUC) fra University of Utah. Frøer har til huse i en IACUC godkendt facilitet. Hanfrøer aflives ved nedsænkning i tricain efter ved at klippe hjertelidten. Kvindelige frøer er anbragt i laboratoriet i højst 24 timer efter hormonel induktion af gydning for at give mulighed for ægopsamling og returneres derefter til plejefaciliteten.
1. Indsamling af X. laevis Testikler
<ol><li>B...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

De vigtigste fordele ved den protokol, der er beskrevet her, er, at den kan afsluttes relativt hurtigt, ikke kræver dyre reagenser og giver en kilde til koncentrerede Tgfß kavalergangsprodukter under fysiologiske forhold. En anden fordel er, at det giver en mulighed for at analysere epitop-taggede proteiner og dermed omgå manglen på kommercielt tilgængelige antistoffer, der genkender de fleste Tgfß familieprodomain. Selvom det også er muligt at analysere kavalergangen af epitopmærkede Tgfß-prækursorproteiner i ...

Medlemmer af Transforming Growth Factor ß (Tgfß) er syntetiseret som inaktive, dimerized forløber proteiner. Prækursorerne er derefter spaltet af medlemmer af proprotein convertase (PC) familie, enten inden for sekretorisk vej eller uden for celler. Dette skaber en aktiv, disulfid-bundet ligand dimer og to fremherskendefragmenter 1. Selv om det har været kendt i over 30 år, at prodomain af Tgfß familie prækursorer er forpligtet til at generere en aktiv ligand2, forståelsen af, hvordan prodomains bidrage til ligand funktion er ufuldstændig.
Selv om forståelsen af processen med proteolytisk aktivering af Tgfß-familiemedlemmer fortsat er ufuldstændig, er der stigende interesse for at forstå, hvilke pc-konsensusmotiver der er spaltet in vivo, om kavalergangen forekommer i et bestemt subcellulært eller ekstracellulært rum, og om prodomain forbliver kovalent eller noncovalent forbundet med den spaltede ligand3. Flere undersøgelser har vist, at prodomain ikke kun guider ligand foldning før kavalergang4,5, men kan også påvirke vækstfaktor stabilitet og rækkevidde af handling6,7,8,9, drive dannelsen af homodimers eller heterodimers10, forankre ligand i den ekstracellulære matrix til at opretholde ligand latency11, og i nogle tilfælde fungere som en ligand i sin egen ret til at aktivere heterologe signalerer12. Heterozygotpunktmutationer inden for mange medlemmer af Tgfß-familien er forbundet med øjen-, knogle-, nyre-, skelet- eller andre defekter hos mennesker3. Disse resultater understreger prodomain's kritiske rolle med hensyn til at skabe og opretholde en aktiv ligand og understreger vigtigheden af at identificere og dechifrere kavalergangsprodukternes rolle, der er udviklet under proteolytisk modning af Tgfß-familieprækursorer.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for aspirerende kavalergangsprodukter, der genereres under modning af Tgfß familieprækursorer fra blastocoele af X. laevis embryoner og derefter analysere dem på immunblots. Denne protokol kan bruges til at afgøre, om et eller flere pc-konsensusmotiver i et prækursorprotein er spaltet i vivo10,13, identificere de endogene pc'er, der spalter hvert motiv13,14, sammenligner in vivo dannelse af Tgfß familie enslyniker versus heterodimers10 eller analysere, om menneskelige sygdomsrelaterede punktmutationer i Tgfß prækursorer påvirker deres evne til at danne funktionelle dimeriske ligands.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

De to arme i superfamilien Transforming Growth Factor ß (Tgfß), repræsenteret ved henholdsvis Tgfß/Nodal eller Bone morfogenetisk protein (Bmp) ligands, spiller en væsentlig rolle i embryonal udvikling og voksen homøostase. Medlemmer af Tgfß-familien er lavet som inaktive prækursorer, der dimeriserer og foldes inden for endoplasmisk reticulum. Forløberen er efterfølgende spaltet i ligand og prodomain fragmenter. Selv om kun dimeric ligand kan engagere Tgfß receptorer og aktivere downstream signalering, der er stigende erkendelse af, at den fremherskende moiety bidrager til ligand aktivitet. I denne artikel beskrives en protokol, der kan bruges til at identificere kavalergangsprodukter, der genereres under aktivering af Tgfß-prækursorproteiner. RNA-kodning af Tgfß-prækursorer injiceres først i X. laevis-embryoner. Den følgende dag indsamles kavalergangsprodukter fra blastocoele af gastrula fase embryoner og analyseres på vestlige blots. Denne protokol kan udfyldes relativt hurtigt, kræver ikke dyre reagenser og giver en kilde til koncentrerede Tgfß kavalergangsprodukter under fysiologiske forhold.

Eksperimentets mål beskrevet nedenfor var at afgøre, om Bmp4 og Bmp7 danner heterodimers (dimers bestående af en Bmp4 ligand og en Bmp7 ligand), homodimers (bestående af to Bmp4 eller to Bmp7 ligands), eller en blanding af hver, når de er co-udtrykt i X. laevis. Data vist i figur 2 er udvundet af en tidligere offentliggjort undersøgelse10. Figur 2A er et skematisk, der viser kavalergangsprodukter, der er genereret ved prote...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Når Transforming Growth Factor ß familie prækursor proteiner er ektopisk udtrykt i Xenopus laevis embryoner, de dimerize, få kløvet og udskilles i blastocoele, som begynder ved den sene blastula til tidlig gastrula fase. Vi beskriver en metode til at aspirere kavalergangsprodukter fra blastocoele hulrum til immunblod analyse.

Analyse af Transforming Growth Factor ß Familie kavalergang produkter udskilles i Blastocoele af Xenopus laevis embryoner

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Denne protokol kan bruges til at studere den proces, hvorved en bredere vifte af adskilte prækursorproteiner, herunder TGF-beta familiemedlemmer, omdannes til aktive proteiner efter proteolytisk kavalergang. Den største fordel ved denne protokol er, at det giver meget hurtige og billige metoder til at opnå stærkt koncentreret TGF-beta kavalergang produkt in vivo under visualiseret tilstand. Til at begynde med, efter injektionen den følgende dag, fjerne Ficoll opløsning og eventuelle døde eller døende embryoner, derefter skylle embryoner en eller to gange med MBS og kultur embryoner i MBS på bænken ved stuetemperatur eller ved 16 grader Celsius i inkubatoren for at bremse udviklingen.Varm og træk glaskapillærerne til et fint punkt ved hjælp af en mikropipettetrækker med de ønskede indstillinger. Ved hjælp af sammenkøjede klip spidsen af en trukket nål. For at forhindre tilstopning skal åbningen af blastocele aspirationsnålen være større end mikroinjektionsnålen.Sæt aspirationsnålen i nåleholderen, der er tilsluttet mikroinjektoren, og fastgør nåleholderen til mikromanipulatoren. Placer tidligt til midten af gastrula fase embryoner i en MBS-fyldt injektion bakke eller parabol. Sæt nålen under embryooverfladen nær dyrestangen.Tryk på fyldknappen på mikroinjektoren, mens du observerer nålen og embryoet gennem et dissekeremikroskop. I løbet af få sekunder stiger niveauet af klar væske i nålen, og embryoet kollapser og bliver konkav. Pulse injicere knappen en eller flere gange for at skubbe alle overskyet hvidt stof ind i nålen, der indeholder snavs eller proteaser.For at opdage kavalergangsprodukterne på immunblotter skal du aspirere blastocelevæsken på 10 til 20 embryoner eller mere afhængigt af antistof. Pipette en mikroliter af kernefrit vand på et paraffinstykke, der er placeret på injektionsbakken. Dyk nålen ned i vanddråben, og tryk på indsprøjtningsknappen for at fjerne blastocelevæsken i vandet.Alternativt, at skubbe væsken direkte på parafilm og forhindre det i at flade ud, puls injicere knappen for at udvise væsken under lavere tryk. Overfør den høstede blastocelevæske til et sterilt mikrocentrifugrør på is og tilsæt kernefrit vand for at justere det endelige volumen til 30 mikroliter. For at opdage TGF-beta prækursor proteiner, overføre blastocele væske udtømte embryoner til et separat rør på is.Fjern overskydende MBS og tilsæt 200 mikroliter af prækølet embryo lysat buffer. For fuldt ud at homogenisere embryonerne skal pipetten op og ned 10 til 20 gange, indtil der ikke er klumper tilbage. Centrifugere de homogeniserede embryoner i en nedkølet mikrocentrifuge ved 10.000 gange G i 10 minutter, fjern derefter 160 mikroliter af supernatanten ved hjælp af en P200 pipette og overfør til et nyt rør på is, idet man er omhyggelig med at undgå de hvide æggeblommeproteiner og andet cellulært snavs i den nederste halvdel af røret.Gentag mikrocentrifugering én gang og overfør 128 mikroliter af den klare supernatant til et nyt rør på is. På dette tidspunkt kan ryddede embryolyater og blastocelevæsken, der opsamles, opbevares ved minus 80 grader Celsius så længe som ønsket. Deglycosylate de spaltede proteiner, der er til stede i blastocelevæske modificeret gennem trans-Golgi-netværket med PNGase F ved at følge producentens anvisninger.De deglycosylerede produkter ville migrere som et mere kondenseret bånd på SDS geler, som kan hjælpe med nøjagtig identifikation. For at vurdere prodomain fragmentmonomerer og udfoldede proteiner i blastocele og lysate, analysere proteinerne under reducerende forhold ved at tilføje fem mikroliters for at reducere 4X prøve buffer til 15 mikroliters blastocelevæske og 15 mikroliter af afklaret embryo lysat. For at vurdere dannelsen af spaltede homodimeriske eller heterodimeriske ligands i blastocele, analysere proteinerne under ikke-reducerende forhold ved at tilføje fem mikroliter af ikke-reducerende 4X prøvebuffer til de resterende 15 mikroliter blastocelevæske, derefter opvarme den i fem minutter og placere den på is.Efter at have brugt denne protokol blev proteinerne adskilt af SDS-PAGE, og immunoblotterne blev undersøgt med antistoffer, der genkendte myc epitop tag. Under de reducerende forhold blev der i lysates fra embryoner, der kun udtrykker Bmp4 eller Bmp7, fundet et enkelt bånd svarende til spaltede Bmp4-monomerer og et langsommere migrerebånd svarende til spaltede Bmp7-monomerer. Begge bånd blev påvist i embryoner co-udtrykke Bmp4 og Bmp7.Når proteinerne blev adskilt under ikke-reducerende forhold, blev der påvist et enkelt modent Bmp4 og 7 heterodimerbånd af mellemmobilitet sammen med en spormængde af Bmp4 homodimer i embryonerne, der var co-udtrykke Bmp4 og Bmp7. Bmp4 og Bmp7 heterodimer dannelse blev også observeret, når Bmp7 protein niveauer var høje. Men i dette tilfælde dannede den overskydende Bmp7 homodimers og embryoner co-udtrykt Bmp4 og Bmp7.Disse resultater viste, at Bmp4 og 7 fortrinsvis danner heterodimerer, når de udtrykkes sammen i Xenopus laevis embryoner. I dette eksperiment er indsamling af ren blastocele det vigtigste skridt, som kræver præcis nålehåndteringsoplevelse. Så bare holde forsøger og fastsættelse af fejl.Denne procedure tester, om BMP heterodimers form, og hvilke aminosyrer er vigtige for dette. Næste skridt, knockin mus kan genereres for at spørge, om disse aminosyrer er funktionelt vigtige under pattedyrs udvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation og<em&gt; In vitro</em&gt; Modning af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocytter, efterfulgt af ICSI, for at studere fosterudviklingen

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genom-dækkende Snapshot af Chromatin Regulators og stater i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoner af Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Brug af Konfokal Analyse af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; At Undersøg Modulatorer af Wnt og Shh Morfogen Gradienter

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder til Præcist Lokaliseret Overførsel af Celler eller DNA i Early implantation museembryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Undertrykkelse af Pro-fibrotisk signalering Potentiates faktor-medieret omprogrammering af musen embryonale fibroblaster til induceret Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Mikroinjektion af DNA i øjen knopper i xenopus laevis embryoner og billeddannelse af Gfp udtrykker optiske Axonal Arbors i intakt, levende xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...