Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Wij danken Mary Sanchez voor de uitstekende verzorging van dieren. Het onderzoek van de auteurs wordt ondersteund door het National Institute of Child Health and Human Development van de National Institutes of Health (NIH / NICHD) subsidies R01HD067473-08 en R21 HD102668-01 en door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subsidie R01DK128068-01.

Alle beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Utah. Kikkers worden gehuisvest in een IACUC-goedgekeurde faciliteit. Mannelijke kikkers worden geëuthanaseerd door onderdompeling in tricaïne na het knippen van de ventrikel van het hart. Vrouwelijke kikkers worden maximaal 24 uur in het laboratorium gehuisvest na hormonale inductie van paaien om het verzamelen van eieren mogelijk te maken en vervolgens teruggebracht naar de zorginstelling.</...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

De belangrijkste voordelen van het hier beschreven protocol zijn dat het relatief snel kan worden voltooid, geen dure reagentia vereist en een bron van geconcentreerde Tgfß-splitsingsproducten biedt onder fysiologische omstandigheden. Een ander voordeel is dat het iemand in staat stelt om epitoop-gelabelde eiwitten te analyseren en zo het tekort aan commercieel beschikbare antilichamen te omzeilen die de meeste Tgfß-familie prodomein herkennen. Hoewel het ook mogelijk is om de splitsing van epitoop-gelabelde Tgfß-voor...

Leden van de Transforming Growth Factor ß (Tgfß) superfamilie worden gesynthetiseerd als inactieve, gedimde voorlopereiwitten. De voorlopers worden vervolgens gesplitst door leden van de proproteïne convertase (PC) familie, hetzij binnen de secretoire route of buiten cellen. Hierdoor ontstaat een actief, disulfide-gebonden liganddimeer en twee prodomeinfragmenten1. Hoewel het al meer dan 30 jaar bekend is dat het prodomein van voorlopers van de Tgfß-familie nodig is om een actief ligand2te genereren, is het begrip van hoe prodomeinen bijdragen aan de ligandfunctie onvolledig.
Hoewel het begrip van het proces van proteolytische activering van Tgfß-familieleden onvolledig blijft, is er een toenemende belangstelling voor het begrijpen welke PC-consensusmotieven in vivoworden gesplitst, of de splitsing plaatsvindt in een specifiek subcellulair of extracellulair compartiment, en of het prodomein covalent of niet-covalent geassocieerd blijft met het gekloofde ligand3. Verschillende studies hebben aangetoond dathet prodomein niet alleen ligandvouwing vóór splitsing4, 5,maar ook de stabiliteit van de groeifactor en het actiebereik6,7,8, 9kan beïnvloeden, de vorming van homodimeren of heterodimeren10kan stimuleren, het ligand in de extracellulaire matrix kan verankeren om ligandlatentie11te behouden en in sommige gevallen als een ligand op zichzelf te functioneren om heterologe te activeren signalering12. Heterozygote puntmutaties binnen het prodomein van veel leden van de Tgfß-familie zijn geassocieerd met oog-, bot-, nier-, skelet- of andere defecten bij mensen3. Deze bevindingen benadrukken de cruciale rol van het prodomein bij het genereren en onderhouden van een actief ligand en benadrukken het belang van het identificeren en ontcijferen van de rol van splitsingsproducten die zijn ontwikkeld tijdens proteolytische rijping van Tgfß-familieprecursoren.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opzuigen van splitsingsproducten die worden gegenereerd tijdens de rijping van Tgfß-familieprecursoren uit de blastocoele van X. laevis-embryo's en analyseren ze vervolgens op immunoblots. Dit protocol kan worden gebruikt om te bepalen of een of meer PC-consensusmotieven in een voorlopereiwit in vivo10,13worden gesplitst, de endogene PC('s) identificeren die elk motief splitsen13,14,in vivo vorming van Tgfß-familiehomodimeren versus heterodimeren10 vergelijken of analyseren of menselijke ziekte-geassocieerde puntmutaties in Tgfß-precursoren hun vermogen om functionele dimerische liganden te vormen beïnvloeden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

De twee armen van de Transforming Growth Factor ß (Tgfß) superfamilie, vertegenwoordigd door respectievelijk Tgfß/Nodal of Bone morphogenetic protein (Bmp) liganden, spelen een essentiële rol in de embryonale ontwikkeling en volwassen homeostase. Leden van de Tgfß-familie worden gemaakt als inactieve voorlopers die dimeriseren en vouwen in het endoplasmatisch reticulum. De voorloper wordt vervolgens gesplitst in ligand- en prodomeinfragmenten. Hoewel alleen het dimerische ligand Tgfß-receptoren kan activeren en stroomafwaartse signalering kan activeren, is er een groeiende erkenning dat het prodomeingedeelte bijdraagt aan ligandactiviteit. In dit artikel wordt een protocol beschreven dat kan worden gebruikt om splitsingsproducten te identificeren die worden gegenereerd tijdens de activering van Tgfß-precursoreiwitten. RNA dat codeert voor Tgfß-voorlopers wordt eerst micro-geïnjecteerd in X. laevis-embryo's. De volgende dag worden splitsingsproducten verzameld uit de blastocoele van gastrula-stadiumembryo's en geanalyseerd op Western blots. Dit protocol kan relatief snel worden voltooid, vereist geen dure reagentia en biedt een bron van geconcentreerde Tgfß-splitsingsproducten onder fysiologische omstandigheden.

Het doel van het experiment dat hieronder wordt beschreven, was om te bepalen of Bmp4 en Bmp7 heterodimeren vormen (dimeren bestaande uit één Bmp4-ligand en één Bmp7-ligand), homodimeren (samengesteld uit twee Bmp4- of twee Bmp7-liganden), of een mengsel van elk wanneer ze samen worden uitgedrukt in X. laevis. De gegevens in figuur 2 zijn afkomstig uit een eerder gepubliceerde studie10. Figuur 2A is een schema van splitsingsp...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Wanneer Transforming Growth Factor ß familie voorloper eiwitten ectopisch tot expressie komen in Xenopus laevis embryo's, worden ze gedimeriseerd, worden ze gesplitst en worden ze uitgescheiden in de blastocoele, die begint bij de late blastula tot vroege gastrula stadium. We beschrijven een methode voor het opzuigen van splitsingsproducten uit de blastocoeleholte voor immunoblotanalyse.

Analyse van transformerende groeifactor ß familiesplitsingsproducten uitgescheiden in de blastocoele van Xenopus laevis-embryo's

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Dit protocol kan worden gebruikt om het proces te bestuderen waarbij een breder scala aan gescheiden precursoreiwitten, waaronder TGF-bèta-familieleden, worden omgezet in actieve eiwitten na proteolytische splitsing. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het zeer snelle en goedkope methoden biedt om hooggeconcentreerd TGF-bètasplitsingsproduct in vivo te verkrijgen onder gevisualiseerde omstandigheden. Om te beginnen, na de injectie op de volgende dag, verwijder Ficoll-oplossing en eventuele dode of stervende embryo's, spoel de embryo's vervolgens een of twee keer met MBS en kweek de embryo's in MBS op de bank bij kamertemperatuur of bij 16 graden Celsius in de couveuse om de ontwikkeling te vertragen.Verwarm en trek de glazen haarvaten tot een fijn punt met behulp van een micropipette puller met de gewenste instellingen. Knip met een tang de punt van een getrokken naald af. Om verstopping te voorkomen, moet de opening van de blastocele-aspiratienaald groter zijn dan de micro-injectiefaald.Steek de aspiratienaald in de naaldhouder die is aangesloten op de micro-injector en bevestig de naaldhouder aan de micromanipulator. Plaats embryo's in het vroege tot midden gastrulastadium in een met MBS gevulde injectiebak of schaal. Steek de naald onder het embryooppervlak in de buurt van de dierenpaal.Druk op de vulknop op de micro-injector terwijl u de naald en het embryo observeert door een ontleedmicroscoop. Na een paar seconden stijgt het niveau van heldere vloeistof in de naald en het embryo stort in en wordt hol. Pulseer de injectieknop een of meer keren om troebele witte stof uit te werpen die vuil of proteasen bevat in de naald.Om de splitsingsproducten op immunoblots te detecteren, aspirateert u de blastocele vloeistof van 10 tot 20 embryo's of meer, afhankelijk van het antilichaam. Pipetteer een microliter kernvrij water op een paraffinestuk dat op de injectiebak is geplaatst. Dompel de naald onder in de waterdruppel en druk op de injectieknop om de blastocelevloeistof in het water te verdrijven.Als alternatief, om de vloeistof rechtstreeks op de parafilm uit te werpen en te voorkomen dat deze afvlakt, pulseert u de injectieknop om de vloeistof onder lagere druk te verdrijven. Breng de geoogste blastocelevloeistof over in een steriele microcentrifugebuis op ijs en voeg kernvrij water toe om het uiteindelijke volume aan te passen aan 30 microliter. Om TGF-bèta-voorlopereiwitten te detecteren, breng je de blastocelevloeistof uitgeputte embryo's over naar een aparte buis op ijs.Verwijder overtollig MBS en voeg 200 microliter voorgekoelde embryolysaatbuffer toe. Om de embryo's volledig te homogeniseren, pipetteer 10 tot 20 keer op en neer totdat er geen klonten overblijven. Centrifugeer de gehomogeniseerde embryo's in een gekoelde microcentrifuge op 10.000 keer G gedurende 10 minuten, verwijder vervolgens 160 microliter van het supernatant met behulp van een P200-pipet en breng over naar een nieuwe buis op ijs, waarbij u voorzichtig bent om de witte dooiereiwitten en ander cellulair afval in de onderste helft van de buis te vermijden.Herhaal de microcentrifugatie eenmaal en breng 128 microliter van het heldere supernatant over naar een nieuwe buis op ijs. Op dit punt kan het opgeruimde embryo lyseren en kan de verzamelde blastocelevloeistof zo lang als gewenst worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius. Deglycosyleer de gesplitste eiwitten die aanwezig zijn in blastocelevloeistof gemodificeerd via het trans-Golgi-netwerk met PNGase F door de instructies van de fabrikant te volgen.De gedeglycosyleerde producten zouden migreren als een meer gecondenseerde band op SDS-gels, wat kan helpen bij een nauwkeurige identificatie. Om de prodomeinfragmentmonomeren en ongevouwen eiwitten in de blastocele en het lysaat te beoordelen, analyseert u de eiwitten onder reducerende omstandigheden door vijf microliter van het verminderen van 4X monsterbuffer toe te voegen aan 15 microliter blastocele vloeistof en 15 microliter geklaard embryolysaat. Om de vorming van gekloofde homodimere of heterodimere liganden in de blastocele te beoordelen, analyseert u de eiwitten onder niet-reducerende omstandigheden door vijf microliter niet-reducerende 4X-monsterbuffer toe te voegen aan de resterende 15 microliter blastocelevloeistof, verwarmt u deze vervolgens gedurende vijf minuten en plaatst u deze op ijs.Na gebruik van dit protocol werden de eiwitten gescheiden door SDS-PAGE en werden de immunoblots onderzocht met antilichamen die de myc epitoop tag herkenden. Onder de reducerende omstandigheden werden in de lysaten van embryo's die alleen Bmp4 of Bmp7 tot expressie kwamen, een enkele band gedetecteerd die overeenkomt met gekloofde Bmp4-monomeren en een langzamer migrerende band die overeenkomt met gekloofde Bmp7-monomeren. Beide banden werden gedetecteerd in embryo's die Bmp4 en Bmp7 co-tot expressie brachten.Wanneer de eiwitten werden gescheiden onder niet-reducerende omstandigheden, werden een enkele volwassen Bmp4- en 7-heterodimeerband van intermediaire mobiliteit gedetecteerd, samen met een sporenhoeveelheid Bmp4-homodimeer in de embryo's die Bmp4 en Bmp7 co-expressien. Bmp4 en Bmp7 heterodimeervorming werd ook waargenomen wanneer Bmp7-eiwitniveaus hoog waren. In dit geval vormde de overtollige Bmp7 echter homodimeren en embryo's co-expressie Bmp4 en Bmp7.Deze resultaten toonden aan dat Bmp4 en 7 bij voorkeur heterodimeren vormen wanneer ze samen tot expressie komen in Xenopus laevis-embryo's. In dit experiment is het verzamelen van pure blastocele de belangrijkste stap die een nauwkeurige naaldbehandeling vereist. Dus blijf gewoon proberen en fouten oplossen.Deze procedure test of BMP heterodimeren zich vormen en welke aminozuren hiervoor belangrijk zijn. De volgende stap kan knockin mouse worden gegenereerd om te vragen of deze aminozuren functioneel belangrijk zijn tijdens de ontwikkeling van zoogdieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...