Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
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Nous remercions Mary Sanchez pour les excellents soins aux animaux. La recherche des auteurs est soutenue par le National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health (NIH / NICHD) subventions R01HD067473-08 et R21 HD102668-01 et par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subvention R01DK128068-01.

Toutes les procédures décrites sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Utah. Les grenouilles sont hébergées dans une installation approuvée par l’IACUC. Les grenouilles mâles sont euthanasiées par immersion dans la tricaïne suivie d’une coupe du ventricule du cœur. Les grenouilles femelles sont hébergées dans le laboratoire pendant un maximum de 24 heures après l’induction hormonale du frai pour permettre la collecte des œufs, puis retourn?...

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	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

Les principaux avantages du protocole décrit ici sont qu’il peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques. Un autre avantage est qu’il permet d’analyser les protéines marquées par épitope et de contourner ainsi la pénurie d’anticorps disponibles dans le commerce qui reconnaissent la plupart des prodomaines de la famille Tgfß. Bien qu’il soit également possible d’ana...

Les membres de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß) sont synthétisés sous forme de protéines précurseurs dimérisées inactives. Les précurseurs sont ensuite clivés par les membres de la famille des proprotéines convertases (PC), soit dans la voie sécrétoire, soit à l’extérieur des cellules. Cela crée un dimère de ligand actif lié au disulfure et deux fragments de prodomaine1. Bien que l’on sache depuis plus de 30 ans que le prodomaine des précurseurs de la famille Tgfß est nécessaire pour générer un ligand2actif, la compréhension de la façon dont les prodomaines contribuent à la fonction du ligand est incomplète.
Bien que la compréhension du processus d’activation protéolytique des membres de la famille Tgfß reste incomplète, il y a un intérêt croissant à comprendre quel(s) motif(s) de consensus PC sont clivés in vivo,si le clivage se produit dans un compartiment subcellulaire ou extracellulaire spécifique, et si le prodomaine reste covalent ou non associé au ligandclivé 3. Plusieurs études ont montré que le prodomaine non seulement guide le repliement des ligands avant leclivage4,5,mais peut également influencer la stabilité du facteur de croissance et l’amplitude d’action6,7,8,9,conduire la formation d’homodimères ou d’hétérodimères10,ancrer le ligand dans la matrice extracellulaire pour maintenir la latence du ligand11et, dans certains cas, fonctionner comme un ligand à part entière pour activer les hétérologues. signalisation12. Les mutations ponctuelles hétérozygotes au sein du prodomaine de nombreux membres de la famille Tgfß sont associées à des anomalies oculaires, osseuses, rénales, squelettiques ou autres chez l’homme3. Ces résultats soulignent le rôle critique du prodomaine dans la génération et le maintien d’un ligand actif et soulignent l’importance d’identifier et de déchiffrer le rôle des produits de clivage développés au cours de la maturation protéolytique des précurseurs de la famille Tgfß.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour aspirer les produits de clivage générés lors de la maturation des précurseurs de la famille Tgfß à partir du blastocoèle des embryons de X. laevis, puis les analyser sur des immunoblots. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si un ou plusieurs motifs de consensus PC dans une protéine précurseur sont clivés in vivo10,13, identifier le ou les PC endogènes qui clivent chaque motif 13,14, comparer la formation in vivo d’homodimères de la famille Tgfß par rapport aux hétérodimères10 ou analyser si les mutations ponctuelles associées à la maladie humaine dans les précurseurs Tgfß ont un impact sur leur capacité à former des ligands dimériques fonctionnels.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

Les deux bras de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß), représentés respectivement par les ligands Tgfß/Nodal ou de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp), jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie adulte. Les membres de la famille Tgfß sont fabriqués comme des précurseurs inactifs qui dimérisent et se replient dans le réticulum endoplasmique. Le précurseur est ensuite clivé en fragments de ligand et de prodomaine. Bien que seul le ligand dimérique puisse engager les récepteurs Tgfß et activer la signalisation en aval, il est de plus en plus reconnu que la fraction prodomaine contribue à l’activité du ligand. Cet article décrit un protocole qui peut être utilisé pour identifier les produits de clivage générés lors de l’activation des protéines précurseurs de Tgfß. Les précurseurs de Tgfß codant pour l’ARN sont d’abord microinjectés dans les embryons de X. laevis. Le lendemain, les produits de clivage sont collectés à partir de la blastocoele d’embryons au stade gastrula et analysés sur des transferts Occidentaux. Ce protocole peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques.

L’objectif de l’expérience décrit ci-dessous était de déterminer si Bmp4 et Bmp7 forment des hétérodimères (dimères composés d’un ligand Bmp4 et d’un ligand Bmp7), des homodimères (composés de deux ligands Bmp4 ou deux ligands Bmp7), ou un mélange de chacun lorsqu’ils sont co-exprimés dans X. laevis. Les données présentées à la figure 2 sont extraites d’une étude publiée précédemment10. La figure 2A</stron...

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Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Lorsque les protéines précurseurs de la famille ß du facteur de croissance transformant sont exprimées ectopiquement dans les embryons de Xenopus laevis, elles se dimérisent, se clivent et sont sécrétées dans le blastocoele, qui commence à la fin de la blastula au stade précoce de gastrula. Nous décrivons une méthode d’aspiration des produits de clivage de la cavité blastocoèle pour l’analyse immunoblot.

Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Ce protocole peut être utilisé pour étudier le processus par lequel un plus large éventail de protéines précurseurs séparées, y compris les membres de la famille TGF-bêta, sont converties en protéines actives après un clivage protéolytique. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit des méthodes très rapides et peu coûteuses pour obtenir un produit de clivage TGF-bêta hautement concentré in vivo dans des conditions visualisées. Pour commencer, après l’injection le lendemain, retirez la solution de Ficoll et tous les embryons morts ou mourants, puis rincez les embryons une ou deux fois avec MBS et culturez les embryons dans MBS sur le banc à température ambiante ou à 16 degrés Celsius dans l’incubateur pour ralentir le développement.Chauffez et tirez les capillaires en verre jusqu’à un point fin à l’aide d’un arracheur de micropipette avec les réglages souhaités. À l’aide d’une pince, coupez la pointe d’une aiguille tirée. Pour éviter le colmatage, l’ouverture de l’aiguille d’aspiration de la blastocèle doit être plus grande que l’aiguille de micro-injection.Insérez l’aiguille d’aspiration dans le porte-aiguille relié au micro-injecteur et fixez le porte-aiguille au micromanipulateur. Placer les embryons au stade de gastrula précoce à moyen dans un plateau d’injection ou un plat rempli de MBS. Insérez l’aiguille sous la surface de l’embryon près du pôle animal.Appuyez sur le bouton de remplissage du micro-injecteur tout en observant l’aiguille et l’embryon à travers un microscope à dissection. En quelques secondes, le niveau de liquide clair augmente dans l’aiguille et l’embryon s’effondre et devient concave. Pulsez le bouton d’injection une ou plusieurs fois pour éjecter toute substance blanche trouble entrant dans l’aiguille contenant des débris ou des protéases.Pour détecter les produits de clivage sur les immunoblots, aspirer le liquide blastocèle de 10 à 20 embryons ou plus selon les anticorps. Pipette un microlitre d’eau sans noyau sur un morceau de paraffine placé sur le plateau d’injection. Immergez l’aiguille dans la goutte d’eau et appuyez sur le bouton d’injection pour dissiper le liquide blastocèle dans l’eau.Alternativement, pour éjecter le fluide directement sur le parafilm et l’empêcher de s’aplatir, actionnez le bouton d’injection pour expulser le fluide sous une pression plus basse. Transférer le fluide blastocèle récolté dans un tube de microcentrifugation stérile sur de la glace et ajouter de l’eau sans noyau pour ajuster le volume final à 30 microlitres. Pour détecter les protéines précurseurs du TGF-bêta, transférez les embryons appauvris en liquide blastocèle dans un tube séparé sur de la glace.Enlevez l’excès de MBS et ajoutez 200 microlitres de tampon de lysate d’embryon pré-réfrigéré. Pour homogénéiser complètement les embryons, pipettez de haut en bas 10 à 20 fois jusqu’à ce qu’il ne reste plus de touffes. Centrifuger les embryons homogénéisés dans une microcentrifugeuse réfrigérée à 10 000 fois G pendant 10 minutes, puis retirer 160 microlitres du surnageant à l’aide d’une pipette P200 et transférer dans un nouveau tube sur glace, en prenant soin d’éviter les protéines de jaune blanc et autres débris cellulaires dans la moitié inférieure du tube.Répétez la microcentrifugation une fois et transférez 128 microlitres du surnageant clair dans un nouveau tube sur glace. À ce stade, les lysates embryonnaires éliminés et le liquide blastocèle collecté peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius aussi longtemps que vous le souhaitez. Déglycosyler les protéines clivées présentes dans le liquide blastocèle modifié par le réseau trans-Golgi avec PNGase F en suivant les instructions du fabricant.Les produits déglycosylés migreraient sous forme de bande plus condensée sur les gels SDS, ce qui peut aider à une identification précise. Pour évaluer les monomères de fragments de prodomaine et les protéines dépliées dans le blastocèle et le lysate, analysez les protéines dans des conditions de réduction en ajoutant cinq microlitres de tampon d’échantillon réducteur 4X à 15 microlitres de liquide blastocèle et 15 microlitres de lysate d’embryon clarifié. Pour évaluer la formation de ligands homodimériques ou hétérodimériques clivés dans le blastocèle, analysez les protéines dans des conditions non réductrices en ajoutant cinq microlitres de tampon d’échantillon 4X non réducteur aux 15 microlitres restants de liquide blastocèle, puis chauffez-le pendant cinq minutes et placez-le sur de la glace.Après avoir utilisé ce protocole, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et les immunoblots ont été sondés avec des anticorps qui reconnaissaient la balise d’épitope myc. Dans les conditions réductrices, dans les lysates d’embryons n’exprimant que Bmp4 ou Bmp7, une seule bande correspondant à des monomères Bmp4 clivés et une bande de migration plus lente correspondant à des monomères Bmp7 clivés ont été détectées. Les deux bandes ont été détectées chez des embryons co-exprimant Bmp4 et Bmp7.Lorsque les protéines ont été séparées dans des conditions non réductrices, une seule bande hétérodimère mature Bmp4 et 7 de mobilité intermédiaire a été détectée ainsi qu’une trace d’homodimère Bmp4 dans les embryons co-exprimant Bmp4 et Bmp7. La formation d’hétérodimères Bmp4 et Bmp7 a également été observée lorsque les niveaux de protéines Bmp7 étaient élevés. Cependant, dans ce cas, l’excès de Bmp7 a formé des homodimères et des embryons co-exprimés Bmp4 et Bmp7.Ces résultats ont démontré que Bmp4 et 7 forment préférentiellement des hétérodimères lorsqu’ils sont co-exprimés dans des embryons de Xenopus laevis. Dans cette expérience, la collecte de blastocèle pur est l’étape la plus importante qui nécessite une expérience précise de la manipulation des aiguilles. Alors continuez simplement à essayer et à corriger les erreurs.Cette procédure teste si les hétérodimères BMP se forment et quels acides aminés sont importants pour cela. L’étape suivante, la souris knockin peut être générée pour demander si ces acides aminés sont fonctionnellement importants pendant le développement des mammifères.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

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Manipulation et<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturation du<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

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Recherche

Biologie du développement

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The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Croissance des follicules Preantral souris sous microgravité simulée

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisation et analyse quantitative de l&#39;angiogenèse embryonnaire dans<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les Cardiomyocytes induites

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...