Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

私たちは、優れた動物のケアのためにメアリー・サンチェスに感謝します。著者らの研究は、国立衛生研究所(NIH/NICHD)の国立小児保健人間開発研究所がR01HD067473-08およびR21 HD102668-01を付与し、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK/NIH)助成金R01DK128068-01によって支援されています。

記載されているすべての手順は、ユタ大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。カエルはIACUC承認施設に収容されています。オスのカエルは、心臓の心室をクリッピングすることによって続くトリカインに浸漬することによって安楽死させられる。雌のカエルは、卵の採取を可能にするために産卵のホルモン誘導に続いて最大24時間実験室に収容され、その後、ケ?...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

ここで説明するプロトコルの主な利点は、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供することです。もう一つの利点は、エピトープタグ付きタンパク質を分析し、ほとんどのTgfßファミリープロドメインを認識する市販の抗体の不足を回避できることです。また、トランスフェクトされた培養哺乳動物細胞におけるエピト...

トランスフォーム成長因子 ß (Tgfß) スーパーファミリーのメンバーは、非活性で二量体化された前駆体タンパク質として合成されます。前駆体は、分泌経路内または細胞外のプロプロテインコンフォーターゼ(PC)ファミリーのメンバーによって切断される。これは、活性なジスルフィド結合リガンドダイマーと2つのプロドメインフラグメント1を作成する。Tgfßファミリー前駆体のプロドメインが活性リガンド2を生成するために必要とされているのは30年以上前から知られているが、プロドメインがリガンド機能にどのように寄与するかを理解することは不完全である。
Tgfßファミリーメンバーのタンパク質分解活性化のプロセスの理解は不完全なままであるが、どのPCコンセンサスモチーフが生体内で切断されるか、切断が特定の細胞内または細胞外区画で起こるか、そしてプロドメインが切断リガンド3と共有結合的にまたは非共変に関連しているかの理解に関心が高まっている。いくつかの研究は、プロドメインが切断4、5の前にリガンド折りたたみを導くだけでなく、成長因子の安定性と作用範囲6、7、8、9に影響を与え、ホモダイマーまたはヘテロ二量体10の形成を促進し、リガンドを細胞外マトリックスに固定してリガンド遅延11を維持し、場合によっては、アガンドとして機能することを示している。 シグナリング12.Tgfßファミリーの多くのメンバーのプロドメイン内のヘテロ接合点突然変異は、ヒトの眼、骨、腎臓、骨格または他の欠陥に関連している3。これらの知見は、プロドメインが活性リガンドを生成および維持する上で重要な役割を強調し、Tgfßファミリー前駆体のタンパク質分解性成熟中に開発された切断産物の役割を同定し、解読することの重要性を強調する。
ここでは、X.ラエビス胚の芽球からTgfßファミリー前駆体の成熟中に生成された切断産物を吸引し、免疫ブロットで分析するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、前駆体タンパク質の1つ以上のPCコンセンサスモチーフが生体内10、13で切断されているかどうかを判断するために使用され、各モチーフ13、14を切断する内因性PCを同定し、Tgfßファミリーホモダイマー対ヘテロダイマー10の生体内形成を比較するか、またはTgfのヒト疾患関連点突然変異をTgfおよびCgのヒト疾患関連点突然変異をTgfの前駆体に対して分析する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

Tgfß/Nodalまたは骨形態形成タンパク質(Bmp)リガンドに代表されるトランスフォーム成長因子ß(Tgfß)スーパーファミリーの2つの腕は、それぞれ胚発生および成人恒常性に不可欠な役割を果たす。Tgfßファミリーのメンバーは、小胞体内で二量体化および折り畳む不活性前駆体として作られる。前駆体は、その後、リガンドおよびプロドメイン断片に切断される。二量体リガンドだけがTgfß受容体を関与させ、下流シグナル伝達を活性化することができるが、プロドメイン部分がリガンド活性に寄与するという認識が高まっている。この記事では、Tgfß前駆体タンパク質の活性化中に生成された切断産物を同定するために使用できるプロトコルについて説明します。Tgfß前駆体をコードするRNAは、まず X.ラエビス 胚にマイクロインジェクションされる。翌日、切断産物はガストルラ期胚の芽球体から採取され、ウェスタンブロットで分析される。このプロトコルは、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供します。

以下に説明する実験の目的は、Bmp4およびBmp7がヘテロダイマー(1つのBmp4リガンドと1つのBmp7リガンドで構成されるダイマー)、ホモダイマー(2つのBmp4または2つのBmp7リガンドで構成される)、またはそれらが Xで 共発現される場合のそれぞれの混合物を決定することであった。 図 2 に示すデータは、以前に発表されたスタディ10から抽出されます。 <...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

変容成長因子ßファミリー前駆体タンパク質が ゼノプス・ラエビス 胚で異所性発現すると、二量体化し、切断され、後期芽胞から早期胃管ステージに至るブラストコエレに分泌される。免疫ブロット解析のためのブラストコア腔から切断産物を吸引する方法について述べている。

ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

このプロトコルは、TGF-βファミリーメンバーを含む分離前駆体タンパク質のより広い範囲が、タンパク質分解切断後の活性タンパク質に変換されるプロセスを研究するために使用することができる。このプロトコルの主な利点は、可視化された条件下で生体内で高濃度のTGF-β切断産物を得るために非常に迅速かつ安価な方法を提供することである。まず、翌日に注射した後、Ficoll溶液と死んだ胚または死んでいる胚を取り除き、胚をMBSで1、2回洗い流し、室温またはインキュベーターのベンチでMBSの胚を培養して発達を遅くする。熱し、希望の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を引っ張ります。鉗子を使用して、引っ張られた針の先端を切り取ります。詰まりを防ぐために、ブラストセレ吸引針の開口部はマイクロインジェクション針よりも大きくする必要があります。マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに吸引針を挿入し、針ホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。MBS充填注入トレイまたは皿に早期から中期の胃ステージ胚を入れます。動物の棒の近くの胚表面の下に針を挿入します。解剖顕微鏡を通して針と胚を観察しながらマイクロインジェクターの充填ボタンを押します。数秒にわたって、針の透明な液体のレベルが上昇し、胚が崩壊して凹状になる。注入ボタンを1回以上パルスして、破片やプロテアーゼを含む針に入る曇った白質を排出します。免疫ブロット上の切断産物を検出するために、抗体に応じて10〜20個以上の胚のブラスト胞液を吸引する。注入皿に置かれるパラフィン片に核を含まない水の1マイクロリットルをピペット。水滴に針を沈め、注入ボタンを押してブラスト胞液を水に払拭します。あるいは、流体を直接パラフィルムに排出し、平坦化を防ぐために、注入ボタンをパルスして、より低い圧力で流体を排出する。採取したブラスト胞液を氷上の無菌マイクロ遠心分離管に移し、核を含まない水を加えて最終体積を30マイクロリットルに調整します。TGF-β前駆体タンパク質を検出するには、胚細胞を破壊した胚を氷上の別のチューブに移します。過剰なMBSを取り除き、200マイクロリットルの冷蔵胚ライセートバッファーを加えます。胚を完全に均質化するために、塊が残らなくなるまで10〜20回上下のピペット。冷蔵マイクロ遠心分離機の均質化胚を10,000倍Gで10分間遠心分離し、P200ピペットを使用して上澄み物の160マイクロリットルを取り除き、氷上の新しいチューブに移し、チューブの下半分の白い黄身タンパク質やその他の細胞破片を避けるように注意してください。マイクロ遠心分離を一度繰り返し、128マイクロリットルの清澄上清を氷上の新しいチューブに移します。この時点で、クリアされた胚のライセートおよび収集されたブラスト胞液は、所望の限りマイナス80°Cで保存することができる。メーカーの指示に従って、PNGase Fとトランスゴルジネットワークを介して修飾されたブラスト胞体流体中に存在する切断タンパク質を脱グリコシル化します。脱糖剤は、SDSゲルのより凝縮されたバンドとして移行し、正確な同定に役立てることができます。ブラスト胞およびリセート中のプロドメインフラグメントモノマーおよび展開タンパク質を評価するには、4Xサンプルバッファーを15マイクロリットルのブラスト胞液および15マイクロリットルの明確な胚ライセートに加えて還元条件下でタンパク質を分析する。ブラストセレ内の切断ホモジメリックまたはヘテロ二量体リガンドの形成を評価するには、非還元4倍サンプルバッファーの5マイクロリットルを残りの15マイクロリットルのブラスト胞液に加えて非還元条件下でタンパク質を分析し、それを5分間加熱して氷の上に置きます。このプロトコルを使用した後、タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫ブロットをmycエピトープタグを認識する抗体でプローブした。還元条件下では、Bmp4またはBmp7のみを発現する胚からのライセートにおいて、切断されたBmp4モノマーに対応する単一のバンドと、切断されたBmp7モノマーに対応する遅い遊覧バンドが検出された。両方のバンドは、Bmp4およびBmp7を共同発現する胚で検出された。タンパク質が非還元条件下で分離されると、Bmp7タンパク質レベルが高い場合には、単一の成熟したBmp4および7ヘテロダイマーバンドの中間移動性が、胚のBmp4ホモジマーの微量と共に検出された。しかし、この場合、過剰なBmp7は、Bmp4とBmp7とを共発現させたホモダイマーおよび胚を形成した。これらの結果は、ゼノプス・ラエビス胚で共発現した場合、Bmp4および7がヘテロ二量体を優先的に形成することを示した。この実験では、純粋なブラストセレを収集することは、正確な針の取り扱い経験を必要とする最も重要なステップです。だから、エラーを試してみて、修正し続けてください。この手順は、BMPヘテロ二量体が形成されるかどうか、また、どのアミノ酸がこれに重要であるかをテストします。次のステップでは、これらのアミノ酸が哺乳類の発達中に機能的に重要であるかどうかを尋ねるために、マウスをノックインが生成することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

発生生物学

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確​​ローカライズ転送する方法

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...