Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
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우리는 훌륭한 동물 관리에 대한 메리 산체스 감사합니다. 저자의 연구는 국립 보건 원 (NIH /NICHD)의 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NIH /NICHD)에 의해 지원됩니다 R01HD067473-08 및 R21 HD102668-01 및 당뇨병 과 소화 및 신장 질환의 국립 연구소에 의해 (NIDDK/NIH) R01DK1208.08.

설명된 모든 절차는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받습니다. 개구리는 IACUC 승인 시설에 보관됩니다. 수컷 개구리는 심장의 심실을 클리핑하여 트리카인에 침수하여 안락사됩니다. 암컷 개구리는 달걀 수집을 허용하기 위해 산란의 호르몬 유도다음 최대 24 시간 동안 실험실에 보관된 다음 치료 시설로 돌아갑니다.
1. X. laevis 고의 컬렉션</...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜의 주요 장점은 비교적 빨리 완료될 수 있고, 고가의 시약을 필요로 하지 않으며, 생리학적 조건 하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공한다는 것이다. 또 다른 장점은 에피토프 태그 단백질을 분석하고 따라서 대부분의 Tgfß 가족 prodomain을 인식하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 부족을 우회할 수 있다는 것입니다. 또한 전감염된 배양 포유류 세포에서 에피토프 ?...

변형 성장 인자 ß (Tgfß) 슈퍼 패밀리의 구성원은 비활성, 이질 전구체 단백질로 합성된다. 전구체는 그 때 분비 통로 내 또는 세포의 외부proprotein 변환기 (PC) 가족의 일원에 의해 갈라지는 것입니다. 이렇게 하면 활성 이황화물 결합 리간드 디머와 두 개의 프로도메인 조각1이생성됩니다. 30년 이상 알려져 왔지만 Tgfß 가족 전구체의 프로도메인이 활성 리간드2를생성하는 데 필요하며, 프로도메인이 리간드 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 이해는 불완전합니다.
Tgfß 가족 구성원의 프로테오리틱 활성화 과정에 대한 이해는 불완전하지만, 특정 세포 외 또는 세포 외 구획에서분열이 발생하는지 여부, 그리고 프로 도메인이 크리브 리간드3와공유 또는 비일관성으로 연관되어 있는지 여부에 대한 이해에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 여러 연구는 프로 도메인이 분열4,5전에 리간드 접이식을 안내 할뿐만 아니라, 또한 성장 인자 안정성과 작용의 범위에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다6,7,8,9,호모이머 또는 이성애자의 형성을 구동10,리간드 대기 시간을 유지하기 위해 세포 외 매트릭스에 리간드 를 고정11,어떤 경우에는, 자신의 오른쪽에 리그간드로 역할을 신호12. Tgfß 가족의 많은 구성원의 프로 도메인 내에서 이종점 돌연변이는 눈, 뼈, 신장, 골격 또는인간3의다른 결함과 관련이 있다. 이 사실 인정은 활성 리간드를 생성하고 유지하는 데 있어 프로도메인의 중요한 역할을 강조하고 Tgfß 가족 전구체의 프로테오리틱 성숙 중에 개발 된 분열 제품의 역할을 식별하고 해독하는 것의 중요성을 강조합니다.
여기에서 우리는 X. laevis 배아의 blastocoele에서 Tgfß 가족 선구자의 성숙 도중 생성된 분열 제품을 심는 다음 면역 blot에 그(것)들을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 전구체 단백질에서 하나 이상의 PC 컨센서스 모티프가 생체10,13에서갈라졌는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 각 모티프(13)를 갈라지는 내인성 PC(들)를 식별할 수있다.,14,Tgfß 가족 homodimers의 생체 형성에서 이성애자(10)를 비교하거나 Tgfß 전구체에서 인간 질병 관련 포인트 돌연변이가 기능성 디메릭 리간드를 형성하는 능력에 영향을 미치는지 여부를 분석한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

Tgfß/Nodal 또는 뼈 형태유전학 단백질(Bmp) 리간드로 표현되는 변형 성장 인자 ß(Tgfß) 슈퍼 패밀리의 두 팔은 배아 발달과 성인 항상성에서 필수적인 역할을 합니다. Tgfß 가족의 구성원은 내시경 망상 내에서 이산화 하고 접는 비활성 전구체로 만들어집니다. 전구체는 이어서 리간드 및 프로도메인 조각으로 갈라진다. 비록 디메라 리간드만 Tgfß 수용체를 참여시키고 다운스트림 신호링을 활성화할 수 있지만, 프로도메인 모이티가 리간드 활동에 기여한다는 인식이 증가하고 있습니다. 이 문서에서는 Tgfß 전구체 단백질의 활성화 중에 생성된 분열 제품을 식별하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. Tgfß 전구체를 코딩하는 RNA는 X. laevis 배아로 처음으로 마이크로 주입됩니다. 다음 날, 분열 제품은 가스트룰라 단계 배아의 blastocoele에서 수집되고 서양 얼룩에서 분석됩니다. 이 프로토콜은 비교적 빨리 완료 될 수 있으며 고가의 시약을 필요로하지 않으며 생리적 조건하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공합니다.

아래에 설명된 실험의 목표는 Bmp4와 Bmp7 형태 이성구(Bmp4 리간드 1개와 Bmp7 리간드 1개로 구성된 디머), 호모디머(Bmp4 또는 2개의 Bmp7 리간드로 구성됨) 또는 X. laevis에서 공동 발현될 때 각각의 혼합물을 결정하는 것이었습니다. 도 2에 표시된 데이터는 이전에 게시된 연구10에서추출된다. 도 2A는 Bmp4 또는 Bmp7 균질 전구체 또는 Bmp4/...

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Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.

제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

이 프로토콜은 TGF-베타 가족 구성원을 포함하여 분리된 전구체 단백질의 넓은 범위가 프로테오리컬 분열 다음 활성 단백질로 변환되는 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 시각화 된 조건하에서 생체 내에서 고농축 TGF 베타 분열 제품을 얻기 위해 매우 빠르고 저렴한 방법을 제공한다는 것입니다. 우선, 다음 날 주사 후, Ficoll 용액과 사망 또는 죽어가는 배아를 제거한 다음 MBS로 한두 번 배아를 헹구고 실온에서 벤치에 있는 MBS의 배아를 실내 온도 또는 인큐베이터의 섭씨 16도에서 배양하여 개발을 늦추도록 합니다.유리 모세 혈관을 원하는 설정으로 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 한 지점으로 가열하고 당깁니다. 집게를 사용하여 당겨낸 바늘 끝을 잘라냅니다. 막힘을 방지하기 위해, 블라스토셀 포부 바늘의 개구부는 미세 주입 바늘보다 커야한다.마이크로인젝터에 연결된 바늘 홀더에 포부를 삽입하고 바늘 홀더를 미세 조작기에 부착합니다. MBS가 채워진 주입 트레이 또는 접시에 일찍 중간 가스트루라 단계 배아를 놓습니다. 동물 극 근처의 배아 표면 아래에 바늘을 삽입합니다.해부 현미경을 통해 바늘과 배아를 관찰하는 동안 마이크로 인젝터의 채우기 버튼을 누릅니다. 몇 초 동안, 맑은 액체의 수준은 바늘에 상승하고 배아가 붕괴하고 오목하게됩니다. 주입 버튼을 한 번 이상 펄스하여 이물질이나 프로테아제가 들어 있는 바늘에 들어오는 흐린 백색 물질을 배출합니다.면역 블롯에 분열 제품을 검출하려면, 항체에 따라 10 에서 20 배아 이상의 blastocele 액체를 흡인. 파이펫 핵없는 물의 마이크로 리터는 사출 트레이에 배치 된 파라핀 조각에. 물 방울에 바늘을 잠그고 주입 버튼을 눌러 blastocele 유체를 물에 방출합니다.대안적으로, 파라필름에 직접 유체를 배출하고 평평해지는 것을 방지하기 위해, 더 낮은 압력하에서 유체를 추방하기 위해 주입 버튼을 펄스한다. 수확한 blastocele 액체를 얼음위에 멸균 미세원심분리기 튜브로 옮기고 핵이 없는 물을 추가하여 최종 부피를 30마이크로리터로 조정합니다. TGF-베타 전구체 단백질을 검출하기 위해, 블락토셀액고갈이 된 배아를 얼음에 있는 별도의 튜브로 이송한다.초과 MBS를 제거하고 미리 냉각 된 배아 용액 버퍼200 마이크로 리터를 추가합니다. 배아를 완전히 균질화하기 위해 덩어리가 남아있을 때까지 파이펫을 10 ~ 20 번 위아래로 합니다. 10분 동안 냉장 된 미세 원심 분리기에서 균질화 된 배아를 원심 분리 한 다음 P200 파이펫을 사용하여 160 마이크로 리터를 제거하고 얼음에 새로운 튜브로 옮겨 튜브의 절반에 있는 흰색 노른자 단백질 및 기타 세포 이물질을 피하십시오.마이크로원심 분리를 한 번 반복하고 투명한 상체의 128마이크로리터를 얼음의 새로운 튜브로 옮긴다. 이 시점에서, 제거된 배아 용액과 수집된 blastocele 액체는 원하는 만큼 영하 80도에서 보관될 수 있다. 제조업체의 지시에 따라 PNGase F와 트랜스 골기 네트워크를 통해 변형된 블라스코셀 액에 존재하는 칼 단백질을 탈충하한다.sDS 젤에 더 응축 된 밴드로 마이그레이션 될 것 이다, 정확한 식별에 도움이 될 수 있는. 블라스토셀과 리세이트에서 프로도메인 단편 단량제 및 전개된 단백질을 평가하기 위해 4X 샘플 버퍼를 15마이크로리터 블래스토셀 유체및 15마이크로리터의 정제된 배아 용액으로 줄이는 5개의 마이크로리터를 추가하여 감소 조건 하에서 단백질을 분석합니다. 블래스토셀레내의 활근 형질 또는 이성구리액 리간드의 형성을 평가하기 위해, 비환량 조건하에서 단백질을 분석하여 4X 샘플 버퍼를 나머지 15 마이크로리터에 추가한 다음 5분 동안 가열하여 얼음위에 놓습니다.이러한 프로토콜을 사용한 후, 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 면역블롯은 myc epitope 태그를 인식하는 항체로 조사되었다. 감소 조건하에서, Bmp4 또는 Bmp7만 을 표현하는 배아로부터 의약하에, Bmp4 단량체와 갈라진 Bmp7 단량에 대응하는 느린 마이그레이션 밴드에 대응하는 단일 밴드가 검출되었다. 두 밴드는 Bmp4와 Bmp7을 공동 발현하는 배아에서 검출되었다.단백질이 비감소 조건 하에서 분리되었을 때, Bmp4와 Bmp7. Bmp7 및 Bmp7 이종구형성을 공동 발현하는 배아에서 Bmp4 호모디머의 미량과 함께 중간 이동성의 단일 성숙한 Bmp4 및 7 이성구가 성역이 검출되었다. 그러나, 이 경우, 초과 Bmp7 형성 호모디머와 배아는 Bmp4와 Bmp7을 공동 발현.이러한 결과는 Bmp4와 7이 제노푸스 라예비스 배아에서 공동 발현될 때 우선적으로 이종성구를 형성한다는 것을 보여주었습니다. 이 실험에서 순수한 블라토셀을 수집하는 것은 정확한 바늘 처리 경험이 필요한 가장 중요한 단계입니다. 그래서 그냥 시도하고 오류를 수정 유지.이 절차는 BMP 이성애가 형성되는지 여부와 어떤 아미노산이 이것에 중요한지 테스트합니다. 다음 단계, 녹핀 마우스는 이러한 아미노산이 포유류 발달 중에 기능적으로 중요한지 여부를 묻기 위해 생성될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

연구

발생학

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...