Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Vi takker Mary Sanchez for utmerket dyrepleie. Forfatternes forskning støttes av National Institute of Child Health and Human Development of the National Institutes of Health (NIH/NICHD) tilskudd R01HD067473-08 og R21 HD102668-01 og av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK/NIH) tilskudd R01DK128068-01.

Alle prosedyrer som er beskrevet er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Universitetet i Utah. Frosker er plassert i et IACUC-godkjent anlegg. Mannlige frosker euthanized av nedsenking i trikain følger ved å klippe hjertets ventrikel. Kvinnelige frosker er plassert i laboratoriet i maksimalt 24 timer etter hormonell induksjon av gyting for å tillate eggsamling og deretter returnert til omsorgsinstitusjonen.
1. Innsamling av X. laevis Testikler
<ol>...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

De viktigste fordelene med protokollen som er beskrevet her, er at den kan fullføres relativt raskt, krever ikke dyre reagenser og gir en kilde til konsentrerte Tgfß spaltingsprodukter under fysiologiske forhold. En annen fordel er at det tillater en å analysere epitopmerkede proteiner og dermed omgå mangelen på kommersielt tilgjengelige antistoffer som gjenkjenner de fleste Tgfß-familiens prodomain. Selv om det også er mulig å analysere spaltingen av epitopmerkede Tgfß forløperproteiner i transfekterte dyrkede...

Medlemmer av Superfamilien Transforming Growth Factor ß (Tgfß) syntetiseres som inaktive, dimeriserte forløperproteiner. Forløperne blir deretter spaltet av medlemmer av proprotein convertase (PC) -familien, enten innenfor sekretorisk bane eller utenfor celler. Dette skaper en aktiv, disulfidbundet ligand dimer og to prodomenefragmenter1. Selv om det har vært kjent i over 30 år at prodomenet til Tgfß-familiens forløpere er nødvendig for å generere en aktiv ligand2, er forståelsen av hvordan prodomener bidrar til ligandfunksjon ufullstendig.
Selv om forståelsen av prosessen med proteolytisk aktivering av Tgfß-familiemedlemmer forblir ufullstendig, er det økende interesse for å forstå hvilke PC-konsensusmotiv(er) som er spaltet i vivo, om spaltingen skjer i et bestemt subcellulært eller ekstracellulært rom, og om prodomenet forblir kovalente eller ikke-kovalent forbundet med den spaltede ligand3. Flere studier har vist at prodomenet ikke bare guider ligand folding før spalting4,5, men kan også påvirke vekstfaktor stabilitet og handlingsområde6,7,8,9, drive dannelsen av homodimers orodimers10, forankre ligand i den ekstracellulære matrisen for å opprettholde ligand latens11, og i noen tilfeller fungere som en ligand i sin egen rett til å aktivere signaliserer12. Heterozygote punktmutasjoner innenfor prodomenet til mange medlemmer av Tgfß-familien er forbundet med øye-, bein-, nyre-, skjelett- eller andre feil hos mennesker3. Disse funnene fremhever prodomenets kritiske rolle i å generere og opprettholde en aktiv ligand og understreke viktigheten av å identifisere og dechiffrere rollen som spaltingsprodukter utviklet under proteolytisk modning av Tgfß-familiens forløpere.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for aspirerende spaltingsprodukter generert under modning av Tgfß-familiens forløpere fra blastocoele av X. laevis embryoer og deretter analysere dem på immunobloter. Denne protokollen kan brukes til å avgjøre om ett eller flere PC-konsensusmotiv(er) i et forløperprotein er spaltet in vivo10,13, identifisere endogene PCer som klemmer hvert motiv13,14, sammenligne in vivo dannelse av Tgfß familie homodimers versus heterodimers10 eller analysere om human sykdom-assosiert punkt mutasjoner i Tgfß forløpere påvirker deres evne til å danne funksjonelle dimeriske ligander.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

De to armene til Superfamilien Transforming Growth Factor ß (Tgfß), representert ved Tgfß/Nodal eller Bone morphogenetic protein (Bmp) ligander, spiller viktige roller i embryonal utvikling og voksen homeostase. Medlemmer av Tgfß-familien er laget som inaktive forløpere som dimmerer og bretter seg i det endoplasmatiske retikulumet. Forløperen blir deretter klemt inn i ligand- og prodomainfragmenter. Selv om bare den dimeriske liganden kan engasjere Tgfß-reseptorer og aktivere nedstrømssignalering, er det økende erkjennelse av at prodomainmoiety bidrar til ligandaktivitet. Denne artikkelen beskriver en protokoll som kan brukes til å identifisere spaltingsprodukter som genereres under aktivering av Tgfß forløperproteiner. RNA-koding Tgfß forløpere blir først mikroinjisert i X. laevis embryoer. Neste dag samles spaltingsprodukter fra blastokolet av gastrula stadium embryoer og analyseres på vestlige flekker. Denne protokollen kan fullføres relativt raskt, krever ikke dyre reagenser og gir en kilde til konsentrerte Tgfß spaltingsprodukter under fysiologiske forhold.

Eksperimentets mål beskrevet nedenfor var å avgjøre om Bmp4 og Bmp7 danner heterodimere (dimers sammensatt av en Bmp4 ligand og en Bmp7 ligand), homodimers (sammensatt av to Bmp4 eller to Bmp7 ligander), eller en blanding av hver når de er co-uttrykt i X. laevis. Data vist i figur 2 er hentet fra en tidligere publisert studie10. Figur 2A er et skjema som viser spaltingsprodukter generert ved proteolytisk modning av Bmp4 eller...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Når Transforming Growth Factor ß familie forløper proteiner er ektopisk uttrykt i Xenopus laevis embryoer, de dimerize, bli cleaved og utskilles i blastocoele, som begynner på sen blastula til tidlig gastrula stadium. Vi beskriver en metode for aspirerende spaltingsprodukter fra blastocoele-hulrommet for immunoblotanalyse.

Analyse av transformerende vekstfaktor ß Family Cleavage Products utskilt til Blastocoele av Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Denne protokollen kan brukes til å studere prosessen der et bredere spekter av segregerte forløperproteiner, inkludert TGF-beta-familiemedlemmer, omdannes til aktive proteiner etter proteolytisk spalting. Den største fordelen med denne protokollen er at den gir svært raske og rimelige metoder for å oppnå høyt konsentrert TGF-beta spalting produkt in vivo under visualisert tilstand. Til å begynne med, etter injeksjonen neste dag, fjern Ficoll-løsningen og eventuelle døde eller døende embryoer, skyll deretter embryoene en eller to ganger med MBS og kultur embryoene i MBS på benken ved romtemperatur eller ved 16 grader Celsius i inkubatoren for å bremse utviklingen.Varm og trekk glasskapillæren til et fint punkt ved hjelp av en mikropipettetrekker med de ønskede innstillingene. Bruk tang, klipp av spissen av en trukket nål. For å forhindre tilstopping, bør åpningen av blastocele aspirasjonsnålen være større enn mikroinjeksjonsnålen.Sett aspirasjonsnålen inn i nåleholderen som er koblet til mikroinjektoren, og fest nåleholderen til mikromanipulatoren. Plasser tidlig til middels gastrula stadium embryoer i en MBS-fylt injeksjonsbrett eller tallerken. Sett nålen under embryooverflaten nær dyrestangen.Trykk på påfyllingsknappen på mikroinjektoren mens du observerer nålen og embryoet gjennom et dissekeringsmikroskop. Over noen få sekunder stiger nivået av klar væske i nålen og embryoet kollapser og blir konkav. Pulser injeksjonsknappen én eller flere ganger for å løse ut uklare hvite stoffer som kommer inn i kanylen som inneholder rusk eller proteaser.For å oppdage spaltingsproduktene på immunobloter, aspirer blastocelevæsken på 10 til 20 embryoer eller mer, avhengig av antistoff. Pipette en mikroliter av kjernefritt vann på et parafinstykke plassert på injeksjonsbrettet. Senk nålen ned i vanndråpen og trykk på injeksjonsknappen for å fjerne blastokoelevæsken i vannet.Alternativt, for å kaste ut væsken direkte på parafilmen og forhindre at den flater ut, pulser injeksjonsknappen for å utvise væsken under lavere trykk. Overfør den høstede blastocelevæsken til et sterilt mikrosenter på is og tilsett kjernefritt vann for å justere det endelige volumet til 30 mikroliter. For å oppdage TGF-beta forløperproteiner, overfør blastocelevæsken utarmede embryoer til et eget rør på is.Fjern overflødig MBS og tilsett 200 mikroliter forhåndskjølt embryolysatbuffer. For å homogenisere embryoene fullt ut, pipette opp og ned 10 til 20 ganger til ingen klumper forblir. Sentrifuger de homogeniserte embryoene i en nedkjølt mikrocentrifuge ved 10.000 ganger G i 10 minutter, fjern deretter 160 mikroliter av supernatanten ved hjelp av en P200 pipette og overfør til et nytt rør på is, og vær forsiktig med å unngå de hvite eggeplommeproteinene og annet cellulært rusk i den nederste halvdelen av røret.Gjenta mikrosentrifugasjonen én gang og overfør 128 mikroliter av den klare supernatanten til et nytt rør på is. På dette tidspunktet kan ryddede embryolysater og blastokelevæsken som samles inn, lagres ved minus 80 grader Celsius så lenge som ønsket. Deglykosylat de spaltede proteinene som finnes i blastocelevæske modifisert gjennom trans-Golgi-nettverket med PNGase F ved å følge produsentens instruksjoner.De deglykosylerte produktene vil migrere som et mer kondensert bånd på SDS geler, noe som kan hjelpe til med nøyaktig identifikasjon. For å vurdere prodomainfragmentmonomerer og utfoldede proteiner i blastokolet og lysate, analyser proteinene under reduserende forhold ved å legge til fem mikroliter med å redusere 4X prøvebuffer til 15 mikroliter blastokoelevæske og 15 mikroliter avklart embryolysat. For å vurdere dannelsen av spaltede homodimeriske eller heteroodimeriske ligander i blastokelen, analyser proteinene under ikke-reduserende forhold ved å legge til fem mikroliter ikke-reduserende 4X prøvebuffer til de resterende 15 mikroliter blastokoelevæsken, varm den deretter i fem minutter og legg den på is.Etter å ha brukt denne protokollen ble proteinene skilt av SDS-PAGE og immunoblotene ble undersøkt med antistoffer som gjenkjente myc epitop-taggen. Under de reduserende forholdene, i lysater fra embryoer som bare uttrykker Bmp4 eller Bmp7, ble det oppdaget et enkelt bånd som tilsvarer spaltede Bmp4-monomerer og et langsommere migrerende bånd som tilsvarer spaltede Bmp7-monomerer. Begge båndene ble påvist i embryoer som uttrykte Bmp4 og Bmp7.Når proteinene ble separert under ikke-reduserende forhold, ble det oppdaget et enkelt modent Bmp4- og 7-heterodimerbånd med mellomliggende mobilitet sammen med en spormengde av Bmp4-homodimer i embryoene som uttrykte Bmp4 og Bmp7. Bmp4 og Bmp7 heterodimerdannelse ble også observert når Bmp7-proteinnivåene var høye. Men i dette tilfellet dannet overskuddet Bmp7 homodimers og embryoer co-uttrykt Bmp4 og Bmp7.Disse resultatene viste at Bmp4 og 7 fortrinnsvis danner heterodimere når de uttrykkes i Xenopus laevis embryoer. I dette eksperimentet er innsamling av ren blastocele det viktigste trinnet som krever presis nålehåndteringserfaring. Så bare fortsett å prøve og fikse feil.Denne prosedyren tester om BMP-heterodimerer dannes og hvilke aminosyrer som er viktige for dette. Neste trinn kan knockinmus genereres for å spørre om disse aminosyrene er funksjonelt viktige under pattedyrutvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulasjon og<em&gt; In Vitro</em&gt; Modning av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocytter, etterfulgt av Intracytoplasmatisk Sperm Injection, for å studere embryoutvikling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot av Chromatin regulatorer og statene i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoer av Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Bruke Confocal Analyse av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; For å undersøke modulatorer av Wnt og Shh Morphogen Gradienter

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder for Nettopp Lokalisert Overføring av celler eller DNA i Early fostertap Mouse Embryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Undertrykkelse av Pro-fibrotiske signalering Potentiates faktor-mediert omprogrammering av mus embryonale fibroblaster til indusert Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection av DNA i Eyebuds i Xenopus laevis embryo og IMAGING av GFP uttrykke optikk axonal arbors i intakt, Living Xenopus rumpetroll

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...