Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Vi tackar Mary Sanchez för utmärkt djurvård. Författarnas forskning stöds av National Institute of Child Health and Human Development of the National Institutes of Health (NIH/NICHD) beviljar R01HD067473-08 och R21 HD102668-01 och av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK/NIH) anslag R01DK128068-01.

Alla beskrivna förfaranden är godkända av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Utah. Grodor är inrymda i en IACUC-godkänd anläggning. Manliga grodor avlivas av nedsänkning i trikain följt genom att klippa hjärtats ventrikel. Kvinnliga grodor är inrymda i laboratoriet i högst 24 timmar efter hormonell induktion av gytning för att möjliggöra äggsamling och sedan återvända till vårdinrättningen.
1. Insamling av X. laevis testikörer
...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

De främsta fördelarna med protokollet som beskrivs här är att det kan slutföras relativt snabbt, kräver inte dyra reagenser och ger en källa till koncentrerade Tgfß klyvningsprodukter under fysiologiska förhållanden. En annan fördel är att det gör det möjligt att analysera epitopmärkta proteiner och därmed kringgå bristen på kommersiellt tillgängliga antikroppar som känner igen de flesta Tgfß-familjens prodomäner. Även om det också är möjligt att analysera klyvningen av epitopmärkta Tgfß preku...

Medlemmar av superfamiljen Transforming Growth Factor ß (Tgfß) syntetiseras som inaktiva, dimeriserade prekursorproteiner. Prekursorerna klyvs sedan av medlemmar av proproteinkonverteringsfamiljen (PC), antingen inom sekretersvägen eller utanför celler. Detta skapar en aktiv, disulfidbunden ligand dimer och två prodomain fragment1. Även om det har varit känt i över 30 år att prodomain av Tgfß familjeprekursorer krävs för att generera en aktiv ligand2, är förståelsen för hur prodomains bidrar till ligand funktion ofullständig.
Även om förståelsen av processen för proteolytisk aktivering av Tgfß familjemedlemmar fortfarande är ofullständig, finns det ett ökande intresse för att förstå vilka PC konsensus motiv som klyvs in vivo, oavsett om klyvningen sker i ett specifikt subcellulärt eller extracellulärt fack, och om prodomänen förblir kovalent eller icke-kovaveriskt associerad med den klyvda ligand3. Flera studier har visat att prodomain inte bara styr ligand vikning föreklyvning 4,5, men kan också påverka tillväxtfaktorstabilitet och handlingsområde6,7,8,9, driva bildandet av homodimers eller heterodimers10, förankra ligand i den extracellulära matrisen för att upprätthålla ligand latens11, och i vissa fall fungera som en ligand i sin egen rätt att aktivera heterolog signalering12. Heterozygous punktmutationer inom prodomänen hos många medlemmar av Tgfß familjen är associerade med öga, ben, njure, skelett eller andra defekter hos människor3. Dessa resultat belyser prodomains kritiska roll för att generera och upprätthålla en aktiv ligand och betonar vikten av att identifiera och dechiffrera rollen av klyvning produkter som utvecklats under proteolytisk mognad av Tgfß familjen föregångare.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för aspirerande klyvning produkter genereras under mognad av Tgfß familjen prekursorer från blastocoele av X. laevis embryon och sedan analysera dem på immunoblots. Detta protokoll kan användas för att avgöra om ett eller flera PC konsensus motiv i ett prekursorprotein klyvs in vivo10,13, identifiera de endogena PC som klyver varje motiv13,14, jämför in vivo bildandet av Tgfß familjen homodimers kontra heterodimers10 eller analysera om mänskliga sjukdom-associerade punktmutationer i Tgfß prekursorer påverkar deras förmåga att bilda funktionella dimeric ligands.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

De två armarna i superfamiljen Transforming Growth Factor ß (Tgfß), representerade av Tgfß/Nodal eller Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, spelar viktiga roller i embryonal utveckling respektive vuxen homeostas. Medlemmar av Tgfß-familjen tillverkas som inaktiva prekursorer som dimeriserar och viker sig inom det endoplasmatiska retikulumet. Föregångaren klyvs därefter i ligand och prodomain fragment. Även om endast dimeric ligand kan engagera Tgfß receptorer och aktivera nedströms signalering, finns det växande erkännande att prodomain moiety bidrar till ligand aktivitet. I den här artikeln beskrivs ett protokoll som kan användas för att identifiera klyvningsprodukter som genereras under aktivering av Tgfß prekursorproteiner. RNA-kodning Tgfß prekursorer är först mikroinjected i X. laevis embryon. Följande dag samlas klyvningsprodukter in från blastocoele av gastrula-stadiumembryon och analyseras på västerländska blök. Detta protokoll kan slutföras relativt snabbt, kräver inte dyra reagenser och ger en källa till koncentrerade Tgfß klyvningsprodukter under fysiologiska förhållanden.

Experimentets mål som beskrivs nedan var att avgöra om Bmp4 och Bmp7 bildar heterodimers (dimers bestående av en Bmp4 ligand och en Bmp7 ligand), homodimers (bestående av två Bmp4 eller två Bmp7 ligands), eller en blandning av var och en när de är samp uttryckta i X. laevis. Data som visas i figur 2 extraheras från en tidigare publicerad studie10. Figur 2A är ett schema som visar klyvningsprodukter som genereras av prot...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

När Transforming Growth Factor ß familjeprekursorproteiner uttrycks extopiskt i Xenopus laevis embryon, de dimerize, blir klyvda och utsöndras i blastocoele, som börjar i slutet av blastula till tidigt gastrula stadium. Vi beskriver en metod för aspirerande klyvning produkter från blastocoele hålighet för immunoblot analys.

Analys av transformerande tillväxtfaktor ß Familjeklyvningsprodukter utsöndras i Blastocoele av Xenopus laevis embryon

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Detta protokoll kan användas för att studera den process genom vilken ett bredare spektrum av segregerade prekursorproteiner, inklusive TGF-beta-familjemedlemmar, omvandlas till aktiva proteiner efter proteolytisk klyvning. Den största fördelen med detta protokoll är att det ger mycket snabba och billiga metoder för att få högkoncentrerad TGF-beta klyvning produkt in vivo under visualiserat skick. Till att börja med, efter injektionen följande dag, ta bort Ficoll-lösningen och eventuella döda eller döende embryon, skölj sedan embryona en eller två gånger med MBS och odla embryona i MBS på bänken vid rumstemperatur eller vid 16 grader Celsius i inkubatorn för att bromsa utvecklingen.Värm och dra glaskapillärerna till en fin punkt med hjälp av en mikropipettedragare med önskade inställningar. Använd tång, kläm av spetsen på en dragen nål. För att förhindra igensättning bör blastocele-aspirationsnålens öppning vara större än mikroinjektionsnålen.Sätt in aspirationsnålen i nålhållaren som är ansluten till mikroinjektorn och fäst nålhållaren på mikromanipulatorn. Placera embryon i tidigt till mitten av gastrulastadiet i en MBS-fylld injektionsbricka eller maträtt. Sätt in nålen under embryoytan nära djurstången.Tryck på fyllningsknappen på mikroinjektorn medan du observerar nålen och embryot genom ett dissekerande mikroskop. Under några sekunder stiger nivån av klar vätska i nålen och embryot kollapsar och blir konkavt. Pulsera injektionsknappen en eller flera gånger för att mata ut grumlig vit materia som kommer in i nålen som innehåller skräp eller proteaser.För att upptäcka klyvningsprodukterna på immunoblots, aspirera blastocelevätskan på 10 till 20 embryon eller mer beroende på antikropp. Pipett en mikroliter av nukleusfritt vatten på en paraffinbit placerad på injektionsbrickan. Sänk ner nålen i vattendroppen och tryck på insprutningsknappen för att skingra blastocelevätskan i vattnet.Alternativt, för att mata ut vätskan direkt på parafilmen och förhindra att den planar ut, pulsera injektorknappen för att driva ut vätskan under lägre tryck. Överför den skördade blastocelevätskan till ett sterilt mikrocentrifugrör på is och tillsätt nukleusfritt vatten för att justera den slutliga volymen till 30 mikroliter. För att upptäcka TGF-beta prekursorproteiner, överför blastocelevätskan utarmade embryon till ett separat rör på is.Ta bort överflödig MBS och tillsätt 200 mikroliter för förkyld embryolyatbuffert. För att helt homogenisera embryona, pipett upp och ner 10 till 20 gånger tills inga klumpar återstår. Centrifugera de homogeniserade embryona i en kyld mikrocentrifug vid 10 000 gånger G i 10 minuter, ta sedan bort 160 mikroliter av supernatanten med en P200-pipett och överför till ett nytt rör på is, var noga med att undvika de vita äggulaproteinerna och annat cellulärt skräp i den nedre halvan av röret.Upprepa mikrocentrifugationen en gång och överför 128 mikroliter av det klara supernatanten till ett nytt rör på is. Vid denna tidpunkt, rensade embryo lysates och blastocele vätska samlas in kan lagras på minus 80 grader Celsius så länge som önskas. Deglykosylera de klyvda proteinerna som finns i blastocelevätska som modifierats genom trans-Golgi-nätverket med PNGase F genom att följa tillverkarens instruktioner.De deglykosylerade produkterna skulle migrera som ett mer kondenserat band på SDS-geler, vilket kan bidra till korrekt identifiering. För att bedöma prodomainfragmentmonomerer och utfällda proteiner i blastocele och lysat, analysera proteinerna under minskande förhållanden genom att tillsätta fem mikroliter för att minska 4X provbuffert till 15 mikroliter blastocelevätska och 15 mikroliter klarna embryolyat. För att bedöma bildandet av klyvda homodimeric eller heterodimeric ligands i blastocele, analysera proteinerna under icke-minskande förhållanden genom att lägga till fem mikroliter av icke-reducerande 4X provbuffert till de återstående 15 mikroliter blastocelevätskan och värm den sedan i fem minuter och placera den på is.Efter att ha använt detta protokoll separerades proteinerna av SDS-PAGE och immunoblots undersöktes med antikroppar som kände igen myc epitope taggen. Under de minskande förhållandena, i lysaterna från embryon som endast uttrycker Bmp4 eller Bmp7, upptäcktes ett enda band som motsvarar klyvda Bmp4 monomerer och ett långsammare migrerande band motsvarande klyvda Bmp7 monomerer. Båda banden upptäcktes i embryon som uttryckte Bmp4 och Bmp7.När proteinerna separerades under icke-minskande villkor upptäcktes en enda mogen Bmp4 och 7 heterodimer band av mellanliggande rörlighet tillsammans med en spårmängd av Bmp4 homodimer i embryona co-expressing Bmp4 och Bmp7. Bmp4 och Bmp7 heterodimer bildandet observerades också när Bmp7 protein nivåer var hög. I detta fall bildade dock överskottet Bmp7 homodimers och embryon co-expressed Bmp4 och Bmp7.Dessa resultat visade att Bmp4 och 7 företrädesvis bildar heterodimers när de uttrycks i Xenopus laevis embryon. I detta experiment är insamling av ren blastocele det viktigaste steget som kräver exakt nålhanteringsupplevelse. Så fortsätt bara att försöka och fixa fel.Detta förfarande testar om BMP heterodimers bildas och vilka aminosyror som är viktiga för detta. Nästa steg kan knockinmus genereras för att fråga om dessa aminosyror är funktionellt viktiga under däggdjursutveckling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulering och<em&gt; In Vitro</em&gt; Mognad av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocyter, följt av intracytoplasmatisk spermieinjektion, att studera embryonal utveckling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genomvid ögonblicksbild av kromatin tillsynsmyndigheter och stater i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryon från Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Använda Konfokal Analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Att undersöka modulatorer av Wnt och Shh Morfogen övertoningar

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder för Exakt Lokaliserad Överföring av celler eller DNA i tidig postimplantationsförlust musembryon

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Dämpning av Pro-fibrotiska signalering potentierar faktor-medierad omprogrammering av mus embryonala fibroblaster till inducerad hjärtmuskelcellerna

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Mikroinjektion av DNA i Ögonknoppar i Xenopus laevis embryon och avbildning av GFP uttrycker optiska Axonala arbors i intakt, levande Xenopus grodyngel

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...