Name: analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Mary Sanchez'e mükemmel hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Yazarların araştırmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NIH/NICHD) tarafından R01HD067473-08 ve R21 HD102668-01 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK/NIH) hibe R01DK128068-01 tarafından desteklenmektedir.

Açıklanan tüm prosedürler Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Kurbağalar IACUC onaylı bir tesiste barındırılıyor. Erkek kurbağalar, kalbin ventrikülünü kırparak trikaine daldırarak ötenaziye tabi tökezlenir. Dişi kurbağalar, yumurta toplanmasına izin vermek için yumurtlamanın hormonal indüksiyonunu takiben laboratuvarda en fazla 24 saat boyunca barındırır ve daha sonra bakım tesisine geri döner.
1. <em...

<ol>
	<li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomains+regulate+the+synthesis,+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands.">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li><li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly.">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li><li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing.">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li><li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activation+of+pro-activin+A.">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052 (2016).</li><li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1.">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor.">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes &amp; Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li><li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity.">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li><li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+stability+determines+signaling+range.">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li><li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice.">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li><li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4/7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo.">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li><li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins.">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth.">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332 (2020).</li><li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin,+PC6,+and+PC7.">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li><li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development.">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development.">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li><li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases.">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li><li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain.">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li><li>Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).</li><li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+Activation+of+Bmps:+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos.">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li><li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4.">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li></ol>

Burada açıklanan protokolün temel avantajları, nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilmesi, pahalı reaktifler gerektirmemesi ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlamasıdır. Başka bir avantaj, epitop etiketli proteinleri analiz etmesine izin etmesi ve böylece çoğu Tgfß ailesi prodomainini tanıyan ticari olarak mevcut antikorların eksikliğini atlatmasıdır. Transfected kültürlü memeli hücrelerinde epitop etiketli Tgfß öncül proteinlerinin bölünmesini ...

Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper aile üyeleri aktif olmayan, küçültücü öncül proteinler olarak sentezlenir. Öncüller daha sonra proprotein convertase (PC) ailesinin üyeleri tarafından salgı yolu içinde veya hücrelerin dışında bölünür. Bu aktif, disülfid bağlı ligand dimer ve iki prodomain parçaları oluşturur1. 30 yılı aşkın bir süredir bilinmesine rağmen, Tgfß ailesinin öncüllerinin prodomaininin aktif bir ligand oluşturmak için gerekli olduğuve 2, prodomainlerin ligand işlevine nasıl katkıda bulunduğuna dair anlayış eksiktir.
Tgfß aile üyelerinin proteolitik aktivasyonu sürecinin anlaşılması eksik kalsa da,hangi PC konsensüs motiflerinin vivo olarak bölündüğünü , dekoltenin belirli bir hücre altı veya hücre dışı bölmede gerçekleşip gerçekleşmediğini ve prodomain'in bölünen ligand3ile birlikte tutarlı veya yaygın olmayan bir şekilde kalıp kalmadığını anlamaya olan ilgi artmaktadır. Çeşitli çalışmalar, prodomain'in sadece4,5bölünmeden önce ligand katlamayı yönlendirdiğinideğil,aynı zamanda büyüme faktörü stabilitesini ve eylem aralığını da etkileyebileceğini göstermiştir 6,7,8,9, homodimer veya heterodimers oluşumunu yönlendirir10, ligand gecikmesini korumak için ligand'ı hücre dışı matrise tutturmak11ve bazı durumlarda, heterologu etkinleştirmek için kendi başına bir ligand işlevi görmek sinyal12. Tgfß ailesinin birçok üyesinin prodomain içindeki heterozipöz nokta mutasyonları, insanlarda göz, kemik, böbrek, iskelet veya diğer kusurlarla ilişkilidir3. Bu bulgular, prodomain'in aktif bir ligand oluşturma ve sürdürmedeki kritik rolünü vurgulamakta ve Tgfß ailesinin öncüllerinin proteolitik olgunlaşması sırasında geliştirilen dekolte ürünlerinin rolünün tanımlanması ve deşifre edilmesi önemini vurgulamaktadır.
Burada, X. laevis embriyolarının blastokoele'sinden Tgfß ailesi öncüllerinin olgunlaşması sırasında üretilen ve daha sonra immünoblotlarda analiz edilen dekolte ürünlerinin aspirasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, öncül proteindeki bir veya daha fazla PC konsensüs motifinin in vivo10 ,13,her motifi13,14'ü ayıran endojen PC'leri tanımlayıp ayırmadığını belirlemek içinkullanılabilir., Tgfß ailesi homodimerlerinin in vivo oluşumunu heterodimerler10 ile karşılaştırın veya Tgfß öncüllerindeki insan hastalığı ilişkili nokta mutasyonlarının fonksiyonel dimerik ligand oluşturma yeteneklerini etkileyip etkilemediğini analiz edin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC125470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C109-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary, 1 X 90 mm</td>
			<td>Narshige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8881501368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 26 G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter Microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>TRS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transforming growth factor &#223; family cleavage products secreted into the blastocoele of xenopus laevis embryos

Sırasıyla Tgfß/Nodal veya Bone morfogenetik protein (Bmp) ligandları tarafından temsil edilen Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper familyasının iki kolu embriyonik gelişim ve yetişkin homeostazında önemli roller oynar. Tgfß ailesinin üyeleri, endoplazmik reticulum içinde küçülen ve katlanan etkin olmayan öncüller olarak yapılır. Öncü daha sonra ligand ve prodomain parçalarına bölünür. Sadece dimerik ligand Tgfß reseptörlerini çalıştırabilse ve aşağı akış sinyalini etkinleştirebilse de, prodomain moiety'nin ligand aktivitesine katkıda bulunduğu giderek artan bir tanıma vardır. Bu makalede, Tgfß öncül proteinlerinin aktivasyonu sırasında oluşturulan bölünme ürünlerini tanımlamak için kullanılabilecek bir protokol açıklanmaktadır. RNA kodlama Tgfß öncülleri ilk olarak X. laevis embriyolarına mikroenjected edilir. Ertesi gün, gastrula evre embriyolarının blastokoelesinden dekolte ürünleri toplanır ve Batı lekeleri üzerinde analiz edilir. Bu protokol nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilir, pahalı reaktifler gerektirmez ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlar.

Deneyin aşağıda açıklanan amacı, Bmp4 ve Bmp7'nin heterodimer (bir Bmp4 ligand ve bir Bmp7 ligand'dan oluşan dimerler), homodimerler (iki Bmp4 veya iki Bmp7 ligand'dan oluşan) veya X. laevis ile birlikte ifade edildiklerinde her birinin bir karışımını mı oluşturduğunu belirlemekti. Şekil 2'de gösterilen veriler daha önce yayınlanmış bir çalışmadan çıkarılır10. Şekil 2A, Bmp4 veya Bmp7 homodimerik ön...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Transforming Growth Factor ÃŸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Büyüme Faktörü ß aile öncül proteinlerinin dönüştürülmesi Xenopus laevis embriyolarında ektopik olarak ifade edildiğinde, küçülürler, bölünürler ve erken gastrula aşamasına geç blastülde başlayan blastokoele salgılanırlar. İmmünoblot analizi için blastocoele boşluğundan dekolte ürünlerini aspire etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Bu protokol, TGF-beta aile üyeleri de dahil olmak üzere daha geniş bir ayrılmış öncül protein yelpazesinin proteolitik bölünmeyi takiben aktif proteinlere dönüştürüldüğü süreci incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün temel avantajı, görselleştirilmiş durumda yüksek konsantre TGF-beta dekolte ürününü in vivo elde etmek için çok hızlı ve ucuz yöntemler sağlamasıdır. Başlangıç olarak, ertesi gün enjeksiyondan sonra, Ficoll çözeltisini ve ölü veya ölmekte olan embriyoları çıkarın, ardından embriyoları MBS ile bir veya iki kez durulayın ve gelişimi yavaşlatmak için embriyoları oda sıcaklığında veya inkübatörde 16 santigrat derecede yedek kulübesinde MBS'de kültüre edin.cam kılcal damarları istediğiniz ayarlara sahip bir mikropipette çekmeci kullanarak ısıtın ve ince bir noktaya çekin. Tokparlap kullanarak, çekilmiş bir iğnenin ucunu kırpın. Tıkanmasını önlemek için blastosel aspirasyon iğnesinin açılması mikroenjeksiyon iğnesinden daha büyük olmalıdır.Aspirasyon iğnesini mikroenjektöre bağlı iğne tutucuya yerleştirin ve iğne tutucuyu mikromanipülatöre takın. Gastrula evre embriyolarını MBS dolu bir enjeksiyon tepsisine veya kabına erken ve orta yerlere yerleştirin. İğneyi embriyo yüzeyinin altına hayvan kutbuna yakın bir şekilde yerleştirin.Bir diseksiyon mikroskobu ile iğneyi ve embriyoyu gözlemlerken mikroinjektördeki doldurma düğmesine basın. Birkaç saniye içinde, iğnede berrak sıvı seviyesi yükselir ve embriyo çöker ve içbükey hale gelir. Enkaz veya proteaz içeren iğneye giren bulutlu beyaz maddeyi çıkarmak için enjekte düğmesini bir veya daha fazla kez darbe.İmmünoblotlardaki bölünme ürünlerini tespit etmek için, antikora bağlı olarak 10 ila 20 embriyo veya daha fazla blastosül sıvısını epire edin. Pipet enjeksiyon tepsisine yerleştirilen bir parafin parçasına bir mikroliter çekirdeksiz su. İğneyi su damlasına batırın ve blastosel sıvısını suya dağıtmak için enjekte düğmesine basın.Alternatif olarak, sıvıyı doğrudan parafilme çıkarmak ve düzleştirmesini önlemek için, sıvıyı daha düşük basınç altında dışarı çıkarmak için enjekte düğmesini darbeleyin. Hasat edilen blastosen sıvısını buz üzerinde steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve son hacmi 30 mikrolitreye ayarlamak için çekirdeksiz su ekleyin. TGF-beta öncül proteinleri tespit etmek için, blastosel sıvısı tükenmiş embriyoları buz üzerinde ayrı bir tüpe aktarın.Fazla MBS'yi çıkarın ve 200 mikrolitre önceden soğutulmuş embriyo lysate tamponu ekleyin. Embriyoları tamamen homojenize etmek için, küme kalmayana kadar 10 ila 20 kez pipet yukarı ve aşağı. Homojenize embriyoları 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de soğutulmuş bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin, ardından bir P200 pipet kullanarak süpernatantın 160 mikrolitresini çıkarın ve tüpün altındaki beyaz yumurta sarısı proteinlerinden ve diğer hücresel döküntülerden kaçınmaya dikkat ederek buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın.Mikrosantrifüjasyonu bir kez tekrarlayın ve berrak süpernatantın 128 mikrolitresini buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Bu noktada temizlenmiş embriyo lysates ve toplanan blastosen sıvısı istanildiği sürece eksi 80 santigrat derecede depolanabilir. Üreticinin talimatlarını izleyerek PNGase F ile trans-Golgi ağı üzerinden modifiye edilmiş blastosel sıvısında bulunan yarıklı proteinleri deglycosylate edin.Deglikosillenmiş ürünler, SDS jellerinde daha yoğun bir bant olarak göç eder ve bu da doğru tanımlamaya yardımcı olabilir. Blastosele ve lisattaki prodomain parça monomerlerini ve katlanmamış proteinleri değerlendirmek için, 4X numune tamponunun 15 mikrolitre blastosel sıvısına ve 15 mikrolitre netleştirilmiş embriyo lisatuna düşürülmesinin beş mikrolitresini ekleyerek proteinleri azaltıcı koşullar altında analiz edin. Blastosende bölünmüş homodimerik veya heterodimerik ligandların oluşumunu değerlendirmek için, kalan 15 mikrolitre blastosel sıvısına beş mikrolitre azaltmayan 4X numune tamponu ekleyerek proteinleri azaltıcı olmayan koşullar altında analiz edin, ardından beş dakika ısıtın ve buza yerleştirin.Bu protokol kullanılarak proteinler SDS-PAGE ile ayrıldı ve immünoblotlar myc epitop etiketini tanıyan antikorlarla araştırıldı. Azaltıcı koşullar altında, sadece Bmp4 veya Bmp7'yi ifade eden embriyolardan elde edilen elyatlarda, bölünmüş Bmp4 monomerlerine karşılık gelen tek bir bant ve bölünmüş Bmp7 monomerlerine karşılık gelen daha yavaş bir göç bandı tespit edildi. Her iki bant da Bmp4 ve Bmp7'yi birlikte ifade eden embriyolarda tespit edildi.Proteinler azaltıcı olmayan koşullarda ayrıldığında, Bmp4 ve Bmp7'yi birlikte ifade eden embriyolarda bmp4 homodimer iz miktarı ile birlikte tek bir olgun Bmp4 ve 7 heterodimer ara hareketlilik bandı tespit edildi. Bmp7 protein düzeyleri yüksek olduğunda Bmp4 ve Bmp7 heterodimer oluşumu da gözlendi. Bununla birlikte, bu durumda, fazla Bmp7 homodimerler oluşturdu ve embriyolar Bmp4 ve Bmp7'yi birlikte ifade etti.Bu sonuçlar, Xenopus laevis embriyolarında birlikte ifade edildiğinde Bmp4 ve 7'nin tercihen heterodimer oluşturduğunu göstermiştir. Bu deneyde, saf blastosen toplamak, hassas iğne taşıma deneyimi gerektiren en önemli adımdır. Bu yüzden denemeye ve hataları düzeltmeye devam edin.Bu prosedür BMP heterodimerlerinin oluşup oluşmadığını ve bunun için hangi amino asitlerin önemli olduğunu test eder. Bir sonraki adım, bu amino asitlerin memeli gelişimi sırasında işlevsel olarak önemli olup olmadığını sormak için knockin faresi üretilebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...