Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

We willen David Rodriguez bedanken voor zijn hulp bij de figuurvoorbereiding. Sputummonsters werden uitgevoerd op de BD LSR II in de UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, ondersteund door UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC bij UT Health) en UL1 TR001120 (CTSA-subsidie).

Alle stappen van de sputumverwerking worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
1. Reagensvoorbereiding voordat met sputumdissociatie wordt begonnen
<ol><li>Ontdooi 1% paraformaldehyde (PFA), 25 ml per monster op ijs en houd koud tot gebruik. LET OP: PFA is giftig bij inademing en huidcontact. Bereid het fixeermiddel volgens de instructies van de fabrikant en vries het tot gebruik in bij -20 °C in 25 ml aliquots.</li>
	<li>Benade...

De cellulaire inhoud van sputum omvat een grote verscheidenheid aan brede cellen, vaak vergezeld van veel puin37. Bovendien vereist sputumanalyse een kwaliteitscontrole die bevestigt dat het monster wordt verzameld uit de long in plaats van de mondholte38. Daarom is het niet zo eenvoudig om sputum te analyseren door flowcytometrie als voor bijvoorbeeld bloed, dat een veel schonere en homogene celsuspensie vrijgeeft. Dit protocol heeft al deze problemen aangepakt: het bieden...

Technische vooruitgang in de hardware en software van flowcytometers heeft het mogelijk gemaakt om veel verschillende celpopulaties tegelijkertijd te identificeren1,2,3,4. Het gebruik van de flowcytometer in hematopoëtisch celonderzoek heeft bijvoorbeeld geleid tot een veel beter begrip van het immuunsysteem2 en de cellulaire hiërarchie van het hematopoëtische systeem5, evenals het diagnostische onderscheid van een veelheid aan verschillende bloedkankers6,7,8. Hoewel de meeste sputumcellen van hematopoëtische oorsprong zijn9,10,11, is flowcytometrie niet op grote schaal toegepast op sputumanalyse voor diagnostische doeleinden. Verschillende studies suggereren echter dat de evaluatie van immuuncelpopulaties in sputum (de belangrijkste subset van cellen) van grote hulp kan zijn bij het diagnosticeren en / of monitoren van ziekten zoals astma en chronische obstructieve longziekte (COPD)12,13,14,15. Bovendien maakt het bestaan van epitheliale specifieke markers die kunnen worden gebruikt in flowcytometrie de ondervraging van de volgende belangrijkste subset van cellen in sputum, longepitheelcellen mogelijk.
Naast het vermogen om veel verschillende celpopulaties van verschillende weefseloorsprongen te analyseren, kan een flowcytometer grote aantallen cellen in een relatief korte periode evalueren. Ter vergelijking: op dia's gebaseerde, cytologische soorten analyses vereisen vaak zeer gespecialiseerd personeel en / of apparatuur. Deze analyses kunnen arbeidsintensief zijn, wat ertoe leidt dat slechts een deel van het sputummonster wordt geanalyseerd16.
Drie kritieke problemen beperken het wijdverbreide gebruik van sputum in flowcytometrie. Het eerste probleem heeft betrekking op het verzamelen van sputum. Sputum wordt verzameld door middel van een hoest die slijm uit de longen in de mondholte verdrijft en vervolgens in een verzamelbeker spuugt. Omdat het slijm door de mondholte reist, is er een grote kans op SEC-besmetting. Deze verontreiniging bemoeilijkt de monsteranalyse, maar het probleem kan gemakkelijk worden verholpen op een flowcytometrisch platform, zoals blijkt uit deze studie.
Niet iedereen kan spontaan sputum produceren; daarom zijn er verschillende apparaten ontwikkeld om te helpen bij het verzamelen van sputum op een niet-invasieve manier17. De vernevelaar is zo'n apparaat en er is aangetoond dat het betrouwbare sputummonsters produceert18,19,20. Hoewel de vernevelaar een zeer effectieve manier is om sputum niet-invasief te verzamelen, vereist het gebruik ervan nog steeds een instelling in een medische faciliteit met gespecialiseerd personeel21. Handheld-apparaten zoals de longfluit22,23,24 en de acapella16,25 kunnen daarentegen thuis worden gebruikt omdat ze zeer gebruiksvriendelijk zijn. Deze hulpmiddelen zijn zowel veilig als kosteneffectief.
Voor ons gaf de acapella consistent betere resultaten dan de longfluit16, en daarom is het acapella-apparaat gekozen voor sputumcollecties. Er werd besloten tot een 3-daags verzamelmonster omdat het primaire doel voor het gebruik van sputum het ontwikkelen van een longkankerdetectietest16 is. Het is aangetoond dat een 3-daagse steekproef de kans op detectie van longkanker verhoogt in vergelijking met een 1- of 2-daagse steekproef26,27,28. Andere methoden voor het verzamelen van sputum kunnen echter de voorkeur hebben voor verschillende doeleinden. Als een andere sputumverzamelingsmethode wordt gebruikt dan de hier beschreven methode, wordt aanbevolen om elk antilichaam of kleurstof dat wordt gebruikt voor flowcytometrische analyse zorgvuldig te titreren; er zijn zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe verschillende sputumverzamelingsmethoden de beoogde eiwitten voor flowcytometrie beïnvloeden.
Het tweede probleem dat het enthousiasme voor het gebruik van sputum voor diagnostiek, voornamelijk gerelateerd aan flowcytometrie, dempt, is het celnummer. Het probleem is het verzamelen van voldoende levensvatbare cellen voor een betrouwbare analyse. Twee studies toonden aan dat sputummonsters verzameld door niet-invasieve methoden, met behulp van een hulpmiddel, voldoende levensvatbare cellen bevatten die kunnen worden gebruikt in klinische diagnose- of onderzoeksstudies16,24. Geen van deze studies ging echter in op de kwestie van celaantallen met betrekking tot flowcytometrie.
Voor de studies die de basis vormen voor dit protocol, werden sputummonsters verzameld van deelnemers met een hoog risico op het ontwikkelen van longkanker volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen voor elke onderzoekslocatie. Deelnemers met een hoog risico werden gedefinieerd als tussen 55-75 jaar, 30 pakjaren gerookt en niet gestopt met roken in de afgelopen 15 jaar. Patiënten kregen te zien hoe ze het acapella-apparaat moesten gebruiken volgens de instructies van de fabrikant29 en verzamelden sputum gedurende drie opeenvolgende dagen thuis. Het monster werd tot de laatste verzameling in de koelkast bewaard. Op de laatste ophaaldag werd het monster 's nachts met een bevroren coldpack naar het laboratorium verscheept. De monsters werden verwerkt tot een enkele celsuspensie op de dag dat ze werden ontvangen. Met deze methode van sputumverzameling worden meer dan voldoende levensvatbare cellen verkregen voor een betrouwbare flowcytometrische analyse.
Ten slotte, en gerelateerd aan de vorige kwestie van het celnummer, is de vraag hoe de sputumcellen uit zijn mucineuze omgeving kunnen worden bevrijd. Hoe kunnen de cellen levensvatbaar worden gehouden en een enkele celsuspensie creëren die de flowcytometer niet verstopt? Gebaseerd op het eerste werk van Pizzichini et al.30 en Miller et al.31, beschrijft dit protocol een eenvoudige en betrouwbare methode voor sputumverwerking tot een enkele celsuspensie die geschikt is voor flowcytometrische analyse. Deze methode heeft gevestigde richtlijnen in flowcytometrie32,33,34 gebruikt om een efficiënte antilichaametiketteringsstrategie te ontwikkelen om hematopoëtische en epitheelcellen in sputum te identificeren en instrumentinstellingen, kwaliteitscontrolemaatregelen en analyserichtlijnen te bieden die sputumanalyse standaardiseren op een flowcytometrisch platform.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Sputum, veel gebruikt om de cellulaire inhoud en andere micro-omgevingskenmerken te bestuderen om de gezondheid van de long te begrijpen, wordt traditioneel geanalyseerd met behulp van cytologie-gebaseerde methodologieën. Het nut ervan is beperkt omdat het lezen van de dia's tijdrovend is en zeer gespecialiseerd personeel vereist. Bovendien maakt uitgebreid puin en de aanwezigheid van te veel plaveiselepitheelcellen (SECs), of wangcellen, een monster vaak ongeschikt voor diagnose. Flowcytometrie daarentegen maakt fenotypering met hoge doorvoer van cellulaire populaties mogelijk, terwijl tegelijkertijd puin en SECs worden uitgesloten.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om sputum te dissociëren in een enkele celsuspensie, antilichaamkleuring en cellulaire populaties te fixeren en monsters te verkrijgen op een flowcytometrisch platform. Een gating-strategie die de uitsluiting van puin, dode cellen (inclusief SECs) en celdubbelts beschrijft, wordt hier gepresenteerd. Verder legt dit werk ook uit hoe levensvatbare, enkele sputumcellen kunnen worden geanalyseerd op basis van een cluster van differentiatie (CD)45 positieve en negatieve populaties om hematopoëtische en epitheliale afstammingssubsets te karakteriseren. Een kwaliteitscontrolemaatregel wordt ook geleverd door longspecifieke macrofagen te identificeren als bewijs dat een monster is afgeleid van de long en geen speeksel is. Ten slotte is aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op verschillende cytometrische platforms door sputumprofielen van dezelfde patiënt te verstrekken die op drie flowcytometers zijn geanalyseerd; Navios EX, LSR II en Lyric. Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd om extra cellulaire markers van belang op te nemen. Een methode om een volledig sputummonster te analyseren op een flowcytometrisch platform wordt hier gepresenteerd dat sputum geschikt maakt voor het ontwikkelen van high-throughput diagnostiek van longziekte.

Dit protocol is ontwikkeld met een klinische laboratoriumomgeving in het achterhoofd. De focus tijdens de ontwikkeling van het protocol lag op eenvoud, efficiëntie en reproduceerbaarheid. Het bleek dat de meest tijdrovende stap in de verwerking van sputum het tellen van de cellen was. Daarom is het protocol zo opgezet dat sputumverwerking en celetikettering onafhankelijk van het tellen van cellen kunnen worden uitgevoerd zonder tijdverlies. Een nauwkeurig celgetal, dat nog steeds nodig is om het monster op de juiste man...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.

Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Dit protocol lost veelvoorkomende uitdagingen op die worden ervaren met sputumverwerking die het in het verleden moeilijk hebben gemaakt om te gebruiken met flowcytometrie voor klinische diagnostische doeleinden met hoge doorvoer. Dit protocol is ontworpen om tijd te besparen door het sputumgewicht te gebruiken om antilichaam- en kleuringsvolumes te bepalen. Tijdens de kleuringsincubatie kan het celgetal worden uitgevoerd voor de stroomafwaartse stappen.Het is belangrijk om een nauwkeurig celgetal te bereiken om het juiste re-suspensievolume te bepalen om problemen bij het uitvoeren op de flowcytometer te voorkomen. Dit protocol kan inzicht geven in onderzoeksgebieden die de gezondheid van de longen onderzoeken. Zo zouden ziekten als COPD, astma, longkanker of de effecten van COVID bestudeerd kunnen worden.De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Michael Lai, een onderzoeks- en ontwikkelingswetenschapper uit mijn laboratorium. Weeg om te beginnen het sputummonster om de volumes dissociatiereagentia te bepalen. Breng het monster over in het vat van de juiste grootte op basis van het sputumgewicht en voeg vervolgens één milliliter per gram 0,5% NAC en vier milliliter per gram 0,1% DTT toe.Vortex de monsters op maximale snelheid gedurende 15 seconden en rock op maximale snelheid gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun dit monster met 4X Hanks gebalanceerde zoutoplossing of HBSS om de NAC en DTT te neutraliseren. En na snel vortexen, rock het monster op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Filter celsuspensie door een 100 micrometer nylon mesh celzeef in een of meer conische centrifugebuizen van 50 milliliter om een eencellige suspensie te creëren. Pellet de cellen naar beneden. Na het aanzuigen van het supernatant, combineer pellets in één conische buis van 15 milliliter en was met HBSS onder dezelfde omstandigheden.Resuspend de celkorrel in een volume buffer dat wordt bepaald door het begingewicht van het sputummonster. Neem een aliquot uit de celsuspensie en meng 10 microliter van de sputumverdunning met 30 microliter van 0,4% trypan blauw en laad vervolgens in de telkamers van een hemocytometer voor een levend / dood celgetal. Label sputum in compensatiebuizen.Voeg HBSS-antilichaam en kleurstof toe aan elke sputumcelbuis en compensatiebuizen zoals aangegeven in de tekst. Voeg de sputumcellen toe aan de testbuizen en voeg compensatieparels toe aan de compensatiebuizen zoals vermeld in de tekst. Incubeer alle buizen op ijs beschermd tegen licht gedurende 35 minuten.Centrifugeer vervolgens na het vullen van de buizen met ijskoude HBSS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 800 keer G.Voor compensatiebuizen, zuig het supernatant zo dicht mogelijk bij de pellets aan en veeg de pellets om los te maken. Voeg vervolgens 0,5 milliliter koude HBSS toe aan de compensatiebuizen en bewaar de buizen op het ijs in een lichtbeschermd gebied totdat het nodig is voor flowcytometrie-analyse. Aspiraleer vervolgens het supernatant uit de onbevlekte, isotype-, bloed- en epitheelbuizen.Maak de pellets los door de buizen te draaien. Voeg twee milliliter van 1% PFA toe aan de onbevlekte en isotypebuizen en 10 milliliter aan de bloed- en epitheelbuizen. Incubeer de buizen op ijs op een lichtbeschermde manier gedurende 30 minuten, vortex dan snel op maximale snelheid en incubaleer opnieuw gedurende nog eens 30 minuten.Vul vervolgens de buisjes met ijskoude HBSS. Centrifugeer vervolgens de buizen bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 1.600 keer G.Aspirateer zoveel mogelijk bovennatuurlijk mogelijk zonder de celkorrel te verstoren en veeg met de vingers over de buis om de cellen los te maken en voeg vervolgens 200 microliter koude HBSS toe aan de niet-gekleurde en isotypebuizen. Bereken en voeg het vereiste volume HBSS toe voor resuspensie van het bloed en de epitheelbuis volgens het totale celgetal.Bewaar alle monsters in compensatiebuizen beschermd tegen licht op het ijs bij vier graden Celsius totdat flowcytometrie-analyse is uitgevoerd. Pas de juiste opstartprocedures toe voor de gebruikte flowcytometer. Gebruik het mengsel van National Institute of Standards and Technology of NIST-kralen om ervoor te zorgen dat voorwaartse strooi- en zijverstrooiingsspanningen worden ingesteld om de NIST-kralen te plaatsen om het perceel te overspannen zonder de kralen te dicht bij de assen te plaatsen.Stel het debiet in op gemiddeld voor LSRII of hoog voor Navios EX. Pas de spanningen aan voor elke parameter die wordt gebruikt voor de scatter- en fluorescentieparameters om de celpopulaties op schaal te plaatsen. Gebruik de cijfers met de gating-strategie als leidraad om de spanningen dienovereenkomstig aan te passen. Verkrijg eerst gegevens voor het niet-gekleurde sputummonster, gevolgd door het isotype bevlekte monster en vervolgens de bloedbuis en de epitheelbuis.Sputumgewicht werd gebruikt om antilichaam- of kleurstofvolumes voor kleuring te bepalen. De correlatie tussen sputumgewicht en celopbrengst was niet sterk. Sputummonsters werden verdeeld in vier gewichtscategorieën, die zich clusterden in de verdeling van de celopbrengst.Elk gebruikt antilichaam werd getitreerd in een concentratie op de plateaufase met de hoogste kleuringsindex als werkconcentratie. In alle gewichtscategorieën was de gemiddelde SEC-besmetting minder dan 20%, waarbij het percentage levensvatbare cellen werd getoond. Gepresenteerd is de gating-strategie die wordt gebruikt voor analyse.NIST-kralen werden gebruikt om een poort in te stellen die op het sputummonster werd aangebracht om puin te verwijderen. Klein puin werd verder geëlimineerd door de breedtepoort. Levensvatbaarheidskleurstof werd gebruikt om dode cellen te elimineren, terwijl de singletpoort doubletten verwijderde.De anti-CD45 antilichaam labeling maakte de scheiding van levende enkele sputumcellen in een bloedcel en een niet-bloedcelcompartiment mogelijk. De profielen verkregen van Navios EX, LSRII en Lyric werden vergeleken. De gating-strategie voor het elimineren van puin, dode cellen, doubletten en het vergelijken van bloed- en niet-bloedprofielen wordt getoond.Deze techniek stelde ons in staat om deze methoden toe te passen om het risico op longkanker op te sporen voor gebruik als een niet-invasieve klinische test.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Met behulp van flowcytometrie

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.