Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation de la figure. Des échantillons d’expectorations ont été exécutés sur le BD LSR II à l’UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, soutenu par UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC à UT Health) et UL1 TR001120 (subvention CTSA).

Toutes les étapes du traitement des expectorations sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique avec l’équipement de protection individuelle approprié.
1. Préparation du réactif avant le début de la dissociation des expectorations
<ol><li>Décongeler 1 % de paraformaldéhyde (PFA), 25 mL par échantillon sur de la glace et garder au froid jusqu’à utilisation. ATTENTION : Le PFA est toxique par inhalation et par contact cutané. Préparer le fixateur conformément ...

Le contenu cellulaire des expectorations comprend une grande variété de cellules très variées, souvent accompagnées de beaucoup de débris37. De plus, l’analyse des expectorations nécessite un contrôle de la qualité qui confirme que l’échantillon est prélevé dans les poumons au lieu de la cavité buccale38. Par conséquent, il n’est pas aussi simple d’analyser les expectorations par cytométrie en flux que pour le sang, par exemple, qui libère une suspen...

Les progrès techniques dans le matériel et les logiciels des cytomètres de flux ont permis d’identifier simultanément de nombreuses populations cellulaires distinctes1,2,3,4. L’utilisation du cytomètre en flux dans la recherche sur les cellules hématopoïétiques, par exemple, a permis de mieux comprendre le système immunitaire2 et la hiérarchie cellulaire du système hématopoïétique5, ainsi que la distinction diagnostique d’une multitude de cancers du sang différents6,7,8. Bien que la plupart des cellules des expectorations soient d’origine hématopoïétique9,10,11, la cytométrie en flux n’a pas été largement appliquée à l’analyse des expectorations à des fins diagnostiques. Cependant, plusieurs études suggèrent que l’évaluation des populations de cellules immunitaires dans les expectorations (le sous-ensemble de cellules le plus important) peut être d’une grande aide dans le diagnostic et / ou la surveillance de maladies telles que l’asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)12,13,14,15. De plus, l’existence de marqueurs épithéliaux spécifiques qui peuvent être utilisés en cytométrie en flux permet l’interrogation du sous-ensemble de cellules le plus important suivant dans les expectorations, les cellules épithéliales pulmonaires.
En plus de la capacité d’analyser de nombreuses populations cellulaires distinctes d’origines tissulaires différentes, un cytomètre en flux peut évaluer un grand nombre de cellules dans une période relativement courte. En comparaison, les types d’analyses cytologiques à base de lames nécessitent souvent du personnel et/ou de l’équipement hautement spécialisés. Ces analyses peuvent nécessiter beaucoup de main-d’œuvre, ce qui conduit à l’analyse d’une partie seulement de l’échantillon d’expectorations16.
Trois problèmes critiques limitent l’utilisation généralisée des expectorations en cytométrie en flux. La première question concerne la collecte des expectorations. Les expectorations sont recueillies par une toux qui expulse le mucus des poumons dans la cavité buccale, puis crache dans une tasse de collecte. Étant donné que le mucus se déplace à travers la cavité buccale, il y a un risque élevé de contamination par la SEC. Cette contamination complique l’analyse de l’échantillon, mais le problème est facilement rectifié sur une plate-forme cytométrique en flux, comme le montre cette étude.
Tout le monde ne peut pas produire des expectorations spontanément; par conséquent, plusieurs dispositifs ont été mis au point pour faciliter la collecte des expectorations de manière non invasive17. Le nébuliseur est l’un de ces dispositifs et il a été démontré qu’il produisait des échantillons d’expectorations fiables18,19,20. Bien que le nébuliseur soit un moyen très efficace de collecter les expectorations de manière non invasive, son utilisation nécessite toujours un réglage dans un établissement médical avec du personnel spécialisé21. En revanche, les appareils portatifs tels que la flûte pulmonaire22,23,24 et l’acapella16,25 peuvent être utilisés à la maison car ils sont très conviviaux. Ces dispositifs d’assistance sont à la fois sûrs et rentables.
Pour nous, l’acapella a toujours donné de meilleurs résultats que la flûte pulmonaire16, et par conséquent, le dispositif acapella a été choisi pour les collections d’expectorations. Un échantillon de prélèvement de 3 jours a été décidé parce que le but principal de l’utilisation des expectorations est de développer un test de détection du cancer du poumon16. Il a été démontré qu’un échantillon de 3 jours augmente la probabilité de détection du cancer du poumon par rapport à un échantillon de 1 ou 2 jours26,27,28. Cependant, d’autres méthodes de collecte des expectorations peuvent être préférables à des fins différentes. Si une méthode de collecte des expectorations différente de celle décrite ici est utilisée, il est recommandé de titrer soigneusement chaque anticorps ou colorant utilisé pour l’analyse cytométrique en flux; très peu de données sont disponibles sur la façon dont les différentes méthodes de collecte des expectorations affectent les protéines ciblées pour la cytométrie en flux.
Le deuxième problème qui atténue l’enthousiasme pour l’utilisation des expectorations pour le diagnostic, principalement lié à la cytométrie en flux, est le nombre de cellules. Le problème est la collecte de suffisamment de cellules viables pour une analyse fiable. Deux études ont démontré que les échantillons d’expectorations prélevés par des méthodes non invasives, à l’aide d’un dispositif d’assistance, contiennent suffisamment de cellules viables pouvant être utilisées dans le diagnostic clinique ou les études de recherche16,24. Cependant, aucune de ces études n’a abordé la question du nombre de cellules concernant la cytométrie en flux.
Pour les études qui constituent la base de ce protocole, des échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des participants à risque élevé de développer un cancer du poumon conformément aux directives institutionnelles approuvées pour chaque site d’étude. Les participants à risque élevé ont été définis comme étant âgés de 55 à 75 ans, ayant fumé 30 paquets-années et n’ayant pas cessé de fumer au cours des 15 dernières années. On a montré aux patients comment utiliser le dispositif acapella conformément aux instructions du fabricant29 et ont recueilli des expectorations pendant trois jours consécutifs à la maison. L’échantillon a été conservé au réfrigérateur jusqu’à la dernière collecte. Le dernier jour du prélèvement, l’échantillon a été expédié au laboratoire pendant la nuit avec un compresse froid congelé. Les échantillons ont été transformés en une suspension à cellule unique le jour de leur réception. Avec cette méthode de collecte des expectorations, on obtient plus qu’assez de cellules viables pour une analyse cytométrique en flux fiable.
Enfin, et en relation avec le problème précédent du nombre de cellules, il y a la question de savoir comment libérer les cellules des expectorations de leur environnement mucineux. Comment les cellules peuvent-elles rester viables et créer une suspension cellulaire unique qui n’obstrue pas le cytomètre en flux? Basé sur les travaux initiaux de Pizzichini et al.30 et Miller et al.31, ce protocole décrit une méthode facile et fiable pour le traitement des expectorations en une suspension à cellule unique qui convient à l’analyse cytométrique en flux. Cette méthode a utilisé des lignes directrices bien établies en cytométrie en flux32,33,34 pour développer une stratégie efficace de marquage des anticorps afin d’identifier les cellules hématopoïétiques et épithéliales dans les expectorations et de fournir des paramètres d’instrument, des mesures de contrôle de la qualité et des lignes directrices d’analyse normalisant l’analyse des expectorations sur une plate-forme cytométrique en flux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Les expectorations, largement utilisées pour étudier le contenu cellulaire et d’autres caractéristiques microenvironnementales afin de comprendre la santé du poumon, sont traditionnellement analysées à l’aide de méthodologies cytologiques. Son utilité est limitée car la lecture des diapositives prend beaucoup de temps et nécessite un personnel hautement spécialisé. De plus, des débris étendus et la présence d’un trop grand nombre de cellules épithéliales squameuses (ETC), ou cellules des joues, rendent souvent un échantillon inadéquat pour le diagnostic. En revanche, la cytométrie en flux permet un phénotypage à haut débit des populations cellulaires tout en excluant simultanément les débris et les SEC.
Le protocole présenté ici décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire, tacher les anticorps et fixer les populations cellulaires, et acquérir des échantillons sur une plate-forme cytométrique en flux. Une stratégie de contrôle qui décrit l’exclusion des débris, des cellules mortes (y compris les SEC) et des doublets cellulaires est présentée ici. En outre, ce travail explique également comment analyser des cellules d’expectorations uniques viables basées sur un groupe de populations positives et négatives de différenciation (CD)45 pour caractériser des sous-ensembles de lignées hématopoïétiques et épithéliales. Une mesure de contrôle de la qualité est également fournie en identifiant les macrophages spécifiques aux poumons comme preuve qu’un échantillon est dérivé du poumon et n’est pas de la salive. Enfin, il a été démontré que cette méthode peut être appliquée à différentes plateformes cytométriques en fournissant des profils d’expectorations du même patient analysés sur trois cytomètres de flux; Navios EX, LSR II et Lyric. De plus, ce protocole peut être modifié pour inclure des marqueurs cellulaires supplémentaires d’intérêt. Une méthode d’analyse d’un échantillon d’expectorations entier sur une plate-forme cytométrique en flux est présentée ici qui rend les expectorations utilisables pour le développement de diagnostics à haut débit des maladies pulmonaires.

Ce protocole a été élaboré en tenant compte d’un laboratoire clinique. Lors de l’élaboration du protocole, l’accent a été mis sur la simplicité, l’efficacité et la reproductibilité. Il a été constaté que l’étape la plus longue dans le traitement des expectorations était de compter les cellules. Par conséquent, le protocole est configuré de manière à ce que le traitement des expectorations et l’étiquetage des cellules puissent être effectués indépendamment du comptage des cellules sans p...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Ce protocole décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire et la caractérisation ultérieure de sous-ensembles cellulaires sur des plateformes cytométriques en flux standard.

Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Ce protocole résout les problèmes courants rencontrés avec le traitement des expectorations qui ont rendu difficile dans le passé l’utilisation avec la cytométrie en flux à des fins de diagnostic clinique à haut débit. Ce protocole est conçu pour gagner du temps en utilisant le poids des expectorations pour déterminer les volumes de coloration des anticorps et des colorants. Pendant l’incubation de la coloration, le comptage cellulaire peut être effectué pour les étapes en aval.Il est important d’obtenir un nombre précis de cellules pour déterminer le volume de ressissage correct afin d’éviter tout problème lors de l’exécution sur le cytomètre de flux. Ce protocole peut donner un aperçu des domaines de recherche qui étudient la santé pulmonaire. Par exemple, des maladies telles que la MPOC, l’asthme, le cancer du poumon ou les effets de la COVID pourraient être étudiés.Le Dr Michael Lai, un scientifique en recherche et développement de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation. Transférer l’échantillon dans le récipient de taille appropriée en fonction du poids des expectorations, puis ajouter un millilitre par gramme de 0,5 % NAC et quatre millilitres par gramme de 0,1 % DTT.Vortex les échantillons à la vitesse maximale pendant 15 secondes et roche à vitesse maximale pendant 15 minutes à température ambiante. Diluer cet échantillon avec une solution saline équilibrée 4X Hanks ou HBSS pour neutraliser le NAC et le DTT. Et après un vortex rapide, faites basculer l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes.Filtrer la suspension de la cellule à travers une passoire à cellules maillées en nylon de 100 micromètres dans un ou plusieurs tubes centrifuges coniques de 50 millilitres pour créer une suspension à cellule unique. Pelletez les cellules. Après avoir aspiré le surnageant, mélanger les granulés dans un tube conique de 15 millilitres et laver avec HBSS dans les mêmes conditions.Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations. Prenez une aliquote de la suspension cellulaire et mélangez 10 microlitres de la dilution des expectorations avec 30 microlitres de bleu de trypan à 0,4%, puis chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un nombre de cellules vivantes / mortes. Étiquetez les expectorations dans les tubes de compensation.Ajouter l’anticorps et le colorant HBSS à chaque tube de cellules d’expectorations et tubes de compensation comme indiqué dans le texte. Ajoutez les cellules d’expectorations aux tubes d’essai et ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme mentionné dans le texte. Incuber tous les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 35 minutes.Ensuite, après avoir rempli les tubes avec du HBSS glacé, centrifuger à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 800 fois G.Pour les tubes de compensation, aspirer le surnageant aussi près que possible des pastilles et faire glisser les pastilles pour les desserrer. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de HBSS froid aux tubes de compensation et stockez les tubes sur la glace dans une zone protégée de la lumière jusqu’à ce que cela soit nécessaire pour l’analyse de cytométrie en flux. Ensuite, aspirez le surnageant des expectorations non colorées, de l’isotype, du sang et des trompes épithéliales.Desserrez les granulés en agitant les tubes. Ajouter deux millilitres de PFA à 1% aux tubes non colorés et isotypes et 10 millilitres aux tubes sanguins et épithéliaux. Incuber les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes, puis vortex rapidement à la vitesse maximale et incuber à nouveau pendant 30 minutes supplémentaires.Remplissez ensuite les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1 600 fois G.Aspirez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faites glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules, puis ajoutez 200 microlitres de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes. Calculer et ajouter le volume requis de HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules.Stocker tous les échantillons dans des tubes de compensation protégés de la lumière sur la glace à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’analyse de cytométrie en flux soit effectuée. Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé. Utilisez le mélange de perles du National Institute of Standards and Technology ou du NIST pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes du NIST pour couvrir la parcelle sans placer les perles trop près des axes.Réglez le débit sur moyen pour LSRII ou élevé pour Navios EX. Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires à l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide pour ajuster les tensions en conséquence. Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré de l’isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial.Le poids des expectorations a été utilisé pour déterminer les volumes d’anticorps ou de colorants pour la coloration. La corrélation entre le poids des expectorations et le rendement cellulaire n’était pas forte. Les échantillons d’expectorations ont été divisés en quatre catégories de poids, qui se regroupaient dans la distribution du rendement cellulaire.Chaque anticorps utilisé a été titré dans une concentration sur la phase de plateau avec l’indice de coloration le plus élevé a été choisi comme concentration de travail. Dans toutes les catégories de poids, la contamination moyenne par la SEC était inférieure à 20 %, le pourcentage de cellules viables étant indiqué. La stratégie de contrôle utilisée pour l’analyse est présentée.Les perles du NIST ont été utilisées pour fixer une grille qui a été appliquée sur l’échantillon d’expectorations pour éliminer les débris. Les petits débris ont ensuite été éliminés par la porte de largeur. Le colorant de viabilité a été utilisé pour éliminer les cellules mortes, tandis que la porte singlet a éliminé les doublets.Le marquage des anticorps anti-CD45 a permis la séparation de cellules d’expectorations uniques vivantes en une cellule sanguine et un compartiment non cellulaire. Les profils obtenus de Navios EX, LSRII et Lyric ont été comparés. La stratégie de contrôle pour éliminer les débris, les cellules mortes, les doublets et comparer les profils sanguins et non sanguins est montrée.Cette technique nous a permis d’appliquer ces méthodes pour détecter le risque de cancer du poumon pour une utilisation comme test clinique non invasif.

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Medicine

Unit 1

Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Recherche

Médecine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stéréologique et cytométrie de flux Caractérisation des sous-populations leucocytaires dans les modèles de transitoires ou permanentes ischémie cérébrale

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Par cytométrie en flux

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Méthodologie pour l’Induction de l’expectoration et traitement en laboratoire

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Caractérisation des cellules immunitaires dans les tissus adipeux humains à l’aide de cytométrie en flux

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.