Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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Wir danken David Rodriguez für seine Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Sputum-Proben wurden auf dem BD LSR II in der UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility durchgeführt, unterstützt von UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC bei UT Health) und UL1 TR001120 (CTSA-Zuschuss).

Alle Schritte der Sputumaufbereitung werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt.
1. Reagenzienvorbereitung vor Beginn der Sputumdissoziation
<ol><li>1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml pro Probe auf Eis auftauen und bis zum Gebrauch kalt aufbewahren. VORSICHT: PFA ist giftig durch Einatmen und Hautkontakt. Bereiten Sie das Fixiermittel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und frieren Sie es bei -20 °C in 25 ml Aliq...

Der zelluläre Gehalt des Sputums umfasst eine Vielzahl von weit reichenden Zellen, oft begleitet von vielen Trümmern37. Darüber hinaus erfordert die Sputumanalyse eine Qualitätskontrolle, die bestätigt, dass die Probe aus der Lunge und nicht aus der Mundhöhle entnommen wird38. Daher ist es nicht so einfach, Sputum mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wie es beispielsweise bei Blut der Fall ist, das eine viel sauberere und homogenere Zellsuspension freisetzt. D...

Technische Fortschritte in der Hard- und Software von Durchflusszytometern haben es ermöglicht, viele verschiedene Zellpopulationen gleichzeitig zu identifizieren1,2,3,4. Der Einsatz des Durchflusszytometers in der hämatopoetischen Zellforschung hat beispielsweise zu einem viel besseren Verständnis des Immunsystems2 und der zellulären Hierarchie des hämatopoetischen Systems5 sowie zur diagnostischen Unterscheidung einer Vielzahl verschiedener Blutkrebsarten geführt6,7,8. Obwohl die meisten Sputumzellen hämatopoetischen Ursprungs sind9,10,11, wurde die Durchflusszytometrie nicht weit verbreitet für die Sputumanalyse zu diagnostischen Zwecken eingesetzt. Mehrere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Bewertung von Immunzellpopulationen im Sputum (der bedeutendsten Untergruppe von Zellen) eine große Hilfe bei der Diagnose und / oder Überwachung von Krankheiten wie Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sein kann 12,13,14,15. Darüber hinaus ermöglicht die Existenz von epithelspezifischen Markern, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden können, die Abfrage der folgenden signifikantesten Untergruppe von Zellen im Sputum, Lungenepithelzellen.
Neben der Fähigkeit, viele verschiedene Zellpopulationen unterschiedlicher Gewebeherkunft zu analysieren, kann ein Durchflusszytometer eine große Anzahl von Zellen in relativ kurzer Zeit auswerten. Im Vergleich dazu erfordern folienbasierte, zytologische Analysen oft hochspezialisiertes Personal und/oder Equipment. Diese Analysen können arbeitsintensiv sein, was dazu führt, dass nur ein Teil der Sputumprobe analysiert wird16.
Drei kritische Punkte begrenzen die weit verbreitete Verwendung von Sputum in der Durchflusszytometrie. Die erste Frage bezieht sich auf die Sammlung von Sputum. Sputum wird durch einen Huff-Husten gesammelt, der Schleim aus der Lunge in die Mundhöhle ausstößt und anschließend in einen Sammelbecher spuckt. Da der Schleim durch die Mundhöhle wandert, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit einer SEC-Kontamination. Diese Kontamination erschwert die Probenanalyse, aber das Problem kann leicht auf einer durchflusszytometrischen Plattform behoben werden, wie in dieser Studie gezeigt.
Nicht jeder kann spontan Sputum produzieren; Daher wurden mehrere Geräte entwickelt, um die Sputumsammlung auf nicht-invasive Weise zu unterstützen17. Der Vernebler ist ein solches Gerät und produziert nachweislich zuverlässige Auswurfproben18,19,20. Obwohl der Vernebler eine sehr effektive Möglichkeit ist, Sputum nicht-invasiv zu sammeln, erfordert seine Verwendung immer noch eine Einstellung in einer medizinischen Einrichtung mit spezialisiertem Personal21. Im Gegensatz dazu können Handheld-Geräte wie die Lungenflöte22,23,24 und die acapella16,25 zu Hause verwendet werden, da sie sehr benutzerfreundlich sind. Diese Assistenzgeräte sind sowohl sicher als auch kostengünstig.
Für uns lieferte die Acapella durchweg bessere Ergebnisse als die Lungenflöte16, und daher wurde das Acapella-Gerät für Sputumsammlungen ausgewählt. Eine 3-tägige Entnahmeprobe wurde beschlossen, da der Hauptzweck für die Verwendung von Sputum darin besteht, einen Lungenkrebserkennungstest zu entwickeln16. Es hat sich gezeigt, dass eine 3-Tage-Probe die Wahrscheinlichkeit der Lungenkrebserkennung im Vergleich zu einer 1- oder 2-Tage-Probe erhöht26,27,28. Andere Methoden der Sputumsammlung können jedoch für verschiedene Zwecke vorzuziehen sein. Wenn eine andere Sputumsammelmethode als die hier beschriebene verwendet wird, wird empfohlen, jeden Antikörper oder Farbstoff, der für die durchflusszytometrische Analyse verwendet wird, sorgfältig zu titrieren. Es liegen nur sehr wenige Daten darüber vor, wie sich verschiedene Sputumsammelmethoden auf die Zielproteine für die Durchflusszytometrie auswirken.
Das zweite Thema, das die Begeisterung für die Verwendung von Sputum für die Diagnostik dämpft, vor allem im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie, ist die Zellzahl. Das Problem ist die Sammlung von ausreichend lebensfähigen Zellen für eine zuverlässige Analyse. Zwei Studien zeigten, dass Sputumproben, die mit hilfe eines Hilfsgeräts mit nicht-invasiven Methoden entnommen wurden, genügend lebensfähige Zellen enthalten, die in klinischen Diagnose- oder Forschungsstudien verwendet werden können16,24. Keine dieser Studien befasste sich jedoch mit der Frage der Zellzahlen in Bezug auf die Durchflusszytometrie.
Für die Studien, die die Grundlage für dieses Protokoll bilden, wurden Sputumproben von Teilnehmern mit hohem Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs nach genehmigten institutionellen Richtlinien für jeden Studienstandort gesammelt. Hochrisikoteilnehmer wurden als zwischen 55 und 75 Jahren definiert, nachdem sie 30 Packungsjahre geraucht und in den letzten 15 Jahren nicht mit dem Rauchen aufgehört hatten. Den Patienten wurde gezeigt, wie sie das Acapella-Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers29 verwenden und Sputum an drei aufeinanderfolgenden Tagen zu Hause sammelten. Die Probe wurde bis zur letzten Entnahme im Kühlschrank aufbewahrt. Am letzten Abholtag wurde die Probe über Nacht mit einer gefrorenen Kühlpackung ins Labor geschickt. Die Proben wurden am Tag ihres Eingangs zu einer einzelnen Zellsuspension verarbeitet. Mit dieser Methode der Sputumgewinnung werden mehr als genug lebensfähige Zellen für eine zuverlässige durchflusszytometrische Analyse gewonnen.
Schließlich, und im Zusammenhang mit dem vorherigen Problem der Zellzahl, stellt sich die Frage, wie die Sputumzellen aus ihrer muzinösen Umgebung freigesetzt werden können. Wie können die Zellen lebensfähig gehalten werden und eine einzelne Zellsuspension erzeugen, die das Durchflusszytometer nicht verstopft? Basierend auf ersten Arbeiten von Pizzichini et al.30 und Miller et al.31 beschreibt dieses Protokoll eine einfache und zuverlässige Methode zur Sputumverarbeitung zu einer Einzelzellsuspension, die für die durchflusszytometrische Analyse geeignet ist. Diese Methode hat etablierte Richtlinien in der Durchflusszytometrie32,33,34 verwendet, um eine effiziente Antikörpermarkierungsstrategie zu entwickeln, um hämatopoetische und epitheliale Zellen im Sputum zu identifizieren und Instrumenteneinstellungen, Qualitätskontrollmaßnahmen und Analyserichtlinien bereitzustellen, die die Sputumanalyse auf einer durchflusszytometrischen Plattform standardisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Sputum, weit verbreitet, um den zellulären Inhalt und andere mikroumweltliche Merkmale zu untersuchen, um die Gesundheit der Lunge zu verstehen, wird traditionell mit zytologischen Methoden analysiert. Sein Nutzen ist begrenzt, da das Lesen der Folien zeitaufwendig ist und hochspezialisiertes Personal erfordert. Darüber hinaus machen ausgedehnte Trümmer und das Vorhandensein von zu vielen Plattenepithelzellen (SECs) oder Wangenzellen eine Probe oft für die Diagnose ungeeignet. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung zellulärer Populationen bei gleichzeitigem Ausschluss von Trümmern und SECs.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um Sputum in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, Antikörper zu färben und zelluläre Populationen zu fixieren und Proben auf einer durchflusszytometrischen Plattform zu entnehmen. Eine Gating-Strategie, die den Ausschluss von Trümmern, toten Zellen (einschließlich SECs) und Zelldouletten beschreibt, wird hier vorgestellt. Darüber hinaus erklärt diese Arbeit auch, wie lebensfähige, einzelne Sputumzellen basierend auf einem Cluster von Differenzierungspopulationen (CD) 45 positiven und negativen Populationen analysiert werden können, um hämatopoetische und epitheliale Abstammungsuntergruppen zu charakterisieren. Eine Qualitätskontrollmaßnahme wird auch durch die Identifizierung lungenspezifischer Makrophagen als Beweis dafür bereitgestellt, dass eine Probe aus der Lunge stammt und kein Speichel ist. Schließlich wurde gezeigt, dass diese Methode auf verschiedene zytometrische Plattformen angewendet werden kann, indem Sputumprofile desselben Patienten bereitgestellt werden, die auf drei Durchflusszytometern analysiert wurden. Navios EX, LSR II und Lyric. Darüber hinaus kann dieses Protokoll modifiziert werden, um zusätzliche zelluläre Marker von Interesse aufzunehmen. Hier wird eine Methode zur Analyse einer gesamten Sputumprobe auf einer durchflusszytometrischen Plattform vorgestellt, die Sputum für die Entwicklung einer Hochdurchsatzdiagnostik von Lungenerkrankungen geeignet macht.

Dieses Protokoll wurde mit Blick auf ein klinisches Labor entwickelt. Der Fokus bei der Entwicklung des Protokolls lag auf Einfachheit, Effizienz und Reproduzierbarkeit. Es wurde festgestellt, dass der zeitaufwendigste Schritt bei der Verarbeitung von Sputum das Zählen der Zellen war. Daher ist das Protokoll so aufgebaut, dass die Sputumverarbeitung und Zellmarkierung unabhängig von der Zellzählung ohne Zeitverlust durchgeführt werden kann. Eine genaue Zellzahl, die immer noch notwendig ist, um die Probe für einen u...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.

Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Dieses Protokoll löst häufige Herausforderungen bei der Sputumverarbeitung, die es in der Vergangenheit schwierig gemacht haben, mit der Durchflusszytometrie für klinische Hochdurchsatz-Diagnosezwecke verwendet zu werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, indem das Sputumgewicht zur Bestimmung des Antikörper- und Farbstofffärbungsvolumens verwendet wird. Während der Färbeinkubation kann die Zellzählung für die nachgeschalteten Schritte durchgeführt werden.Es ist wichtig, eine genaue Zellzahl zu erreichen, um das richtige Resuspensionsvolumen zu bestimmen, um Probleme beim Betrieb auf dem Durchflusszytometer zu vermeiden. Dieses Protokoll kann Einblicke in Forschungsbereiche geben, die die Lungengesundheit untersuchen. So könnten beispielsweise Krankheiten wie COPD, Asthma, Lungenkrebs oder die Auswirkungen von COVID untersucht werden.Das Verfahren wird dr. Michael Lai, ein Forschungs- und Entwicklungswissenschaftler aus meinem Labor, demonstrieren. Wiegen Sie zunächst die Sputumprobe, um das Volumen der Dissoziationsreagenzien zu bestimmen. Die Probe wird in das entsprechend große Gefäß auf der Grundlage des Auswurfgewichts überführt und dann ein Milliliter pro Gramm 0,5 % NAC und vier Milliliter pro Gramm 0,1 % DVB-T zugegeben.Wirbeln Sie die Proben mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Sekunden und rocken Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie diese Probe mit 4X Hanks Balanced Salt Solution oder HBSS, um NAC und DTT zu neutralisieren. Und nach schnellem Wirbeln die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur schaukeln.Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100 Mikrometer langes Nylon-Mesh-Zellsieb in ein oder mehrere konische Zentrifugenröhrchen mit 50 Millilitern, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Pelletieren Sie die Zellen. Nach dem Absaugen des Überstandes die Pellets in einem konischen 15-Milliliter-Rohr kombinieren und unter den gleichen Bedingungen mit HBSS waschen.Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffervolumen, das durch das Anfangsgewicht der Sputumprobe bestimmt wird. Nehmen Sie ein Aliquot aus der Zellsuspension und mischen Sie 10 Mikroliter der Sputumverdünnung mit 30 Mikrolitern 0,4% Trypanblau und laden Sie dann in die Zählkammern eines Hämozytometers für eine lebende / tote Zellzahl. Sputum in Kompensationsröhrchen beschriften.Fügen Sie HBSS-Antikörper und Farbstoff zu jedem Sputumzellröhrchen und Kompensationsröhrchen hinzu, wie im Text angegeben. Fügen Sie die Sputumzellen zu den Assay-Röhrchen hinzu und fügen Sie den Kompensationsröhrchen Kompensationskügelchen hinzu, wie im Text erwähnt. Inkubieren Sie alle Röhren 35 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis.Dann, nachdem Sie die Röhrchen mit eiskaltem HBSS gefüllt haben, zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 800 mal G.Für Kompensationsröhrchen den Überstand so nah wie möglich an den Pellets absaugen und die Pellets zum Lösen bewegen. Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter kaltes HBSS zu den Kompensationsröhrchen hinzu und lagern Sie die Röhrchen auf dem Eis in einem lichtgeschützten Bereich, bis sie für die Durchflusszytometrie-Analyse benötigt werden. Dann aspirieren Sie den Überstand aus dem Sputum ungefärbt, Isotyp, Blut und Epithelröhren.Lösen Sie die Pellets, indem Sie die Röhrchen streichen. Fügen Sie zwei Milliliter von 1% PFA zu den ungefärbten und Isotyp-Röhrchen und 10 Milliliter zu den Blut- und Epithelröhren hinzu. Inkubieren Sie die Röhren auf Eis lichtgeschützt für 30 Minuten, dann schnell mit maximaler Geschwindigkeit wirbeln und erneut für weitere 30 Minuten inkubieren.Füllen Sie dann die Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 1.600 mal G.Aspiratieren Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören, und streichen Sie das Röhrchen mit den Fingern, um die Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 200 Mikroliter kaltes HBSS zu den ungefärbten und Isotyp-Röhren hinzu. Berechnen und addieren Sie das erforderliche HbSS-Volumen für die Resuspension des Blutes und des Epithelschlauchs entsprechend der Gesamtzellzahl.Lagern Sie alle Proben in Kompensationsröhrchen, die bei vier Grad Celsius vor Licht auf dem Eis geschützt sind, bis eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. Wenden Sie geeignete Startverfahren für das verwendete Durchflusszytometer an. Verwenden Sie die Mischung aus National Institute of Standards and Technology oder NIST-Perlen, um sicherzustellen, dass Vorwärtsstreu- und Seitenstreuspannungen so eingestellt sind, dass die NIST-Perlen so platziert werden, dass sie das Diagramm überspannen, ohne die Perlen zu nahe an den Achsen zu platzieren.Stellen Sie die Durchflussrate für LSRII auf mittel oder für Navios EX auf hoch ein. Passen Sie die Spannungen für jeden Parameter an, der für die Streu- und Fluoreszenzparameter verwendet wird, um die Zellpopulationen in großem Maßstab zu platzieren. Verwenden Sie die Zahlen mit der Gating-Strategie als Orientierung, um die Spannungen entsprechend anzupassen. Erfassen Sie zuerst Daten für die ungefärbte Sputumprobe, gefolgt von der isotypgefärbten Probe und dann für das Blutröhrchen und das Epithelrohr.Das Sputumgewicht wurde verwendet, um das Antikörper- oder Farbstoffvolumen für die Färbung zu bestimmen. Die Korrelation zwischen Sputumgewicht und Zellausbeute war nicht stark. Sputumproben wurden in vier Gewichtsklassen eingeteilt, die sich in der Verteilung der Zellausbeute gruppierten.Jeder verwendete Antikörper wurde in einer Konzentration auf der Plateauphase titriert, wobei der höchste Färbeindex als Arbeitskonzentration gewählt wurde. In allen Gewichtsklassen betrug die durchschnittliche SEC-Kontamination weniger als 20%, wobei der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen gezeigt wurde. Vorgestellt wird die für die Analyse verwendete Gating-Strategie.NIST-Perlen wurden verwendet, um ein Tor zu setzen, das auf die Sputumprobe aufgebracht wurde, um Ablagerungen zu beseitigen. Kleine Trümmer wurden durch das breite Tor weiter beseitigt. Lebensfähigkeitsfarbstoff wurde verwendet, um tote Zellen zu eliminieren, während das Singulett-Tor Dubletten entfernte.Die Anti-CD45-Antikörpermarkierung ermöglichte die Trennung von lebenden einzelnen Sputumzellen in eine Blutzelle und ein Nicht-Blutzellkompartiment. Die von Navios EX, LSRII und Lyric erhaltenen Profile wurden verglichen. Die Gating-Strategie zur Beseitigung von Trümmern, toten Zellen, Dubletten und zum Vergleich von Blut- und Nicht-Blutprofilen wird gezeigt.Diese Technik ermöglichte es uns, diese Methoden anzuwenden, um das Lungenkrebsrisiko für die Verwendung als nicht-invasiver klinischer Test zu erkennen.

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Forschung

Medizin

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Mittels Durchflusszytometrie

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.