Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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हम आंकड़े की तैयारी के साथ उनकी सहायता के लिए डेविड रोड्रिगेज को धन्यवाद देना चाहते हैं। थूक के नमूने यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सुविधा में बीडी एलएसआर II पर चलाए गए थे, जो यूटी हेल्थ, एनआईएच-एनसीआई पी 30 सीए054174-20 (यूटी हेल्थ में सीटीआरसी) और यूएल 1 टीआर 001120 (सीटीएसए अनुदान) द्वारा समर्थित था।

थूक प्रसंस्करण के सभी चरणों को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणके साथ एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है।
1. थूक पृथक्करण शुरू करने से पहले अभिकर्मक तैयारी
<ol><li>1% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफ...

थूक की सेलुलर सामग्री में व्यापक कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता शामिल है, जो अक्सर बहुत सारे मलबे के साथ होती है37। इसके अलावा, थूक विश्लेषण के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता होती है जो पुष्ट...

प्रवाह साइटोमीटर के हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में तकनीकी प्रगति ने एक साथ कई अलग-अलग सेल आबादी की पहचान करना संभव बना दिया है1,2,3,4। हेमटोपोइएटिक सेल अनुसंधान में प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली 2 और हेमटोपोइएटिक सिस्टम 5 के सेलुलर पदानुक्रम की बेहतर समझ के साथ-साथ विभिन्न रक्त कैंसर की भीड़ के नैदानिक अंतर को जन्म दिया है6,7,8। यद्यपि अधिकांश थूक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक मूल की हैं9,10,11, फ्लो साइटोमेट्री को नैदानिक उद्देश्यों के लिए थूक विश्लेषण पर व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है। हालांकि, कई अध्ययनों से पता चलता है कि थूक (कोशिकाओं का सबसे महत्वपूर्ण सबसेट) में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का मूल्यांकन अस्थमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 12,13,14,15 जैसी बीमारियों के निदान और / या निगरानी में बहुत मदद कर सकता है। इसके अलावा, उपकला-विशिष्ट मार्करों का अस्तित्व जो प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किया जा सकता है, थूक, फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं में कोशिकाओं के निम्नलिखित सबसे महत्वपूर्ण सबसेट की पूछताछ की अनुमति देता है।
विभिन्न ऊतक मूल के कई अलग-अलग सेल आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता के अलावा, एक प्रवाह साइटोमीटर अपेक्षाकृत कम अवधि में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का मूल्यांकन कर सकता है। इसकी तुलना में, स्लाइड-आधारित, साइटोलॉजिकल प्रकार के विश्लेषणों के लिए अक्सर अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों और / या उपकरणों की आवश्यकता होती है। ये विश्लेषण श्रम-गहन हो सकते हैं, जो थूक के नमूने का केवल एक अनुपात विश्लेषण किया जा रहा है16 की ओर जाता है।
तीन महत्वपूर्ण मुद्दे प्रवाह साइटोमेट्री में थूक के व्यापक उपयोग को सीमित करते हैं। पहला मुद्दा थूक के संग्रह से संबंधित है। थूक को एक हफ खांसी के माध्यम से एकत्र किया जाता है जो फेफड़ों से बलगम को मौखिक गुहा में निष्कासित करता है, बाद में एक संग्रह कप में थूकता है। चूंकि बलगम मौखिक गुहा के माध्यम से यात्रा करता है, इसलिए एसईसी संदूषण की एक उच्च संभावना है। यह संदूषण नमूना विश्लेषण को जटिल बनाता है, लेकिन समस्या को आसानी से एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर ठीक कर दिया जाता है, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है।
हर कोई अनायास थूक का उत्पादन नहीं कर सकता है; इसलिए, कई उपकरणों को एक गैर-आक्रामक तरीके से थूक संग्रह के साथ सहायता करने के लिए विकसित किया गया है17। नेबुलाइज़र एक ऐसा उपकरण है और इसे विश्वसनीय थूक के नमूनों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है18,19,20। हालांकि नेबुलाइज़र गैर-आक्रामक रूप से थूक एकत्र करने का एक बहुत ही प्रभावी तरीका है, इसके उपयोग के लिए अभी भी विशेष कर्मियों के साथ एक चिकित्सा सुविधा में एक सेटिंग की आवश्यकता होती है21। इसके विपरीत, फेफड़ों की बांसुरी 22,23,24 और एकापेला 16,25 जैसे हैंडहेल्ड उपकरणों का उपयोग घर पर किया जा सकता है क्योंकि वे बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं। ये सहायता उपकरण दोनों सुरक्षित और लागत प्रभावी हैं।
हमारे लिए, अकापेला ने फेफड़ों की बांसुरी 16 की तुलना में लगातार बेहतर परिणाम दिए, और इसलिए, एकापेला डिवाइस को थूक संग्रह के लिए चुना गया है। एक 3-दिवसीय संग्रह नमूना तय किया गया था क्योंकि थूक का उपयोग करने का प्राथमिक उद्देश्य फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने वाले परीक्षण 16 को विकसित करना है। यह दिखाया गया है कि 3-दिवसीय नमूना 1- या 2-दिवसीय नमूने 26,27,28 की तुलना में फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है। हालांकि, थूक संग्रह के अन्य तरीके विभिन्न उद्देश्यों के लिए बेहतर हो सकते हैं। यदि यहां वर्णित एक की तुलना में एक अलग थूक संग्रह विधि का उपयोग किया जाता है, तो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी या डाई को सावधानीपूर्वक टाइटरेट करने की सिफारिश की जाती है; बहुत कम डेटा उपलब्ध है कि विभिन्न थूक संग्रह विधियां प्रवाह साइटोमेट्री के लिए लक्षित प्रोटीन को कैसे प्रभावित करती हैं।
निदान के लिए थूक का उपयोग करने के लिए उत्साह को कम करने वाला दूसरा मुद्दा, मुख्य रूप से प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित है, सेल संख्या है। समस्या एक विश्वसनीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं का संग्रह है। दो अध्ययनों से पता चला है कि गैर-इनवेसिव तरीकों द्वारा एकत्र किए गए थूक के नमूनों में, एक सहायता उपकरण की मदद से, पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाएं होती हैं जिनका उपयोग नैदानिक निदान या अनुसंधान अध्ययनों में किया जा सकता है16,24। हालांकि, इन अध्ययनों में से किसी ने भी प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित सेल संख्याओं के मुद्दे को संबोधित नहीं किया।
इस प्रोटोकॉल के लिए आधार बनाने वाले अध्ययनों के लिए, प्रत्येक अध्ययन स्थल के लिए अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए फेफड़ों के कैंसर के विकास के लिए उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों से थूक के नमूने एकत्र किए गए थे। उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों को 55-75 वर्षों के बीच के रूप में परिभाषित किया गया था, जिन्होंने 30 पैक-वर्षों में धूम्रपान किया था और पिछले 15 वर्षों के भीतर धूम्रपान नहीं छोड़ा था। रोगियों को दिखाया गया था कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार एकापेला डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए29 और घर पर लगातार तीन दिनों तक थूक एकत्र किया गया। नमूने को अंतिम संग्रह तक रेफ्रिजरेटर में रखा गया था। अंतिम संग्रह के दिन, नमूने को एक जमे हुए ठंडे पैक के साथ रात भर प्रयोगशाला में भेज दिया गया था। नमूनों को उस दिन एक एकल सेल निलंबन में संसाधित किया गया था जिस दिन वे प्राप्त हुए थे। थूक संग्रह की इस विधि के साथ, एक विश्वसनीय प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं से अधिक प्राप्त किया जाता है।
अंत में, और पिछले सेल नंबर मुद्दे से संबंधित, यह सवाल है कि थूक कोशिकाओं को इसके म्यूकिनस वातावरण से कैसे जारी किया जाए। कोशिकाओं को व्यवहार्य कैसे रखा जा सकता है और एक एकल सेल निलंबन बनाया जा सकता है जो प्रवाह साइटोमीटर को रोक नहींता है? Pizzichini et al.30 और Miller et al.31 द्वारा प्रारंभिक काम के आधार पर, यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक प्रसंस्करण के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है जो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इस विधि ने थूक में हेमटोपोइएटिक और उपकला कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक कुशल एंटीबॉडी लेबलिंग रणनीति विकसित करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर थूक विश्लेषण को मानकीकृत करने वाले उपकरण सेटिंग्स, गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और विश्लेषण दिशानिर्देशों को प्रदान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री 32,33,34 में अच्छी तरह से स्थापित दिशानिर्देशों का उपयोग किया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

थूक, व्यापक रूप से फेफड़ों के स्वास्थ्य को समझने के लिए सेलुलर सामग्री और अन्य माइक्रोएनवायरमेंटल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, पारंपरिक रूप से साइटोलॉजी-आधारित तरीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। इसकी उपयोगिता सीमित है क्योंकि स्लाइड पढ़ना समय लेने वाला है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, व्यापक मलबे और बहुत अधिक स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (एसईसी), या गाल कोशिकाओं की उपस्थिति, अक्सर निदान के लिए अपर्याप्त नमूना प्रदान करती है। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर आबादी के उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि एक साथ मलबे और एसईसी को छोड़कर।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन, एंटीबॉडी दाग और सेलुलर आबादी को ठीक करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर नमूने प्राप्त करने के लिए थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। एक गेटिंग रणनीति जो मलबे, मृत कोशिकाओं (एसईसी सहित) और सेल डबल्स के बहिष्करण का वर्णन करती है, यहां प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यह काम यह भी बताता है कि हेमटोपोइएटिक और उपकला वंश के सबसेट को चिह्नित करने के लिए भेदभाव (सीडी) 45 सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के एक समूह के आधार पर व्यवहार्य, एकल थूक कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए। एक गुणवत्ता नियंत्रण उपाय भी सबूत के रूप में फेफड़ों-विशिष्ट मैक्रोफेज की पहचान करके प्रदान किया जाता है कि एक नमूना फेफड़ों से प्राप्त होता है और लार नहीं होता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस विधि को तीन प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण किए गए एक ही रोगी से थूक प्रोफाइल प्रदान करके विभिन्न साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है; Navios पूर्व, LSR द्वितीय, और गीत. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को ब्याज के अतिरिक्त सेलुलर मार्करों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफ़ॉर्म पर एक पूरे थूक के नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो थूक को फेफड़ों की बीमारी के उच्च-थ्रूपुट निदान के विकास के लिए उपयुक्त बनाती है।

इस प्रोटोकॉल को एक नैदानिक प्रयोगशाला सेटिंग को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया था। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान ध्यान सादगी, दक्षता और पुनरुत्पादन पर था। यह पाया गया कि थूक के प्रसंस्करण में सबसे अ?...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है और मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर सेलुलर सबसेट के बाद के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता-नियंत्रित थूक विश्लेषण

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

यह प्रोटोकॉल थूक प्रसंस्करण के साथ अनुभव की गई सामान्य चुनौतियों को हल करता है जिसने अतीत में उच्च-थ्रूपुट नैदानिक नैदानिक उद्देश्यों के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के साथ उपयोग करना मुश्किल बना दिया है। इस प्रोटोकॉल को एंटीबॉडी और डाई स्टेनिंग वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए थूक वजन का उपयोग करके समय बचाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। धुंधला इनक्यूबेशन के दौरान, डाउनस्ट्रीम चरणों के लिए सेल काउंट किया जा सकता है।प्रवाह साइटोमीटर पर चलते समय किसी भी समस्या को रोकने के लिए सही पुन: निलंबन मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सटीक सेल गिनती प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल फेफड़ों के स्वास्थ्य की जांच करने वाले अनुसंधान के क्षेत्रों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, सीओपीडी, अस्थमा, फेफड़ों के कैंसर जैसी बीमारियों या कोविड के प्रभावों का अध्ययन किया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ माइकल लाई, मेरी प्रयोगशाला से एक अनुसंधान और विकास वैज्ञानिक होगा। शुरू करने के लिए, पृथक्करण अभिकर्मकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए थूक के नमूने का वजन करें। नमूने को थूक के वजन के आधार पर उचित आकार के पोत में स्थानांतरित करें, फिर 0.5% एनएसी के प्रति ग्राम एक मिलीलीटर और 0.1% डीटीटी के प्रति ग्राम चार मिलीलीटर जोड़ें।भंवर 15 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर नमूनों और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर रॉक। एनएसी और डीटीटी को बेअसर करने के लिए 4X हैंक्स संतुलित नमक समाधान या एचबीएसएस के साथ इस नमूने को पतला करें। और त्वरित भंवर के बाद, पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को रॉक करें।एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक या अधिक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक 100 माइक्रोमीटर नायलॉन जाल सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें। कोशिकाओं के नीचे गोली. supernatant aspirating के बाद, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में छर्रों गठबंधन और एक ही शर्तों के तहत HBSS के साथ धोना।थूक के नमूने के प्रारंभिक वजन द्वारा निर्धारित बफर की मात्रा में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन से एक ऐलीकोट लें और 0.4% ट्रिपैन नीले रंग के 30 माइक्रोलीटर के साथ थूक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोलीटर को मिलाएं, फिर एक जीवित / मृत सेल गिनती के लिए हेमोसाइटोमीटर के गिनती कक्षों में लोड करें। क्षतिपूर्ति ट्यूबों में थूक लेबल.प्रत्येक थूक सेल ट्यूब और क्षतिपूर्ति ट्यूब के लिए HBSS एंटीबॉडी और डाई जोड़ें जैसा कि पाठ में इंगित किया गया है। परख ट्यूबों के लिए थूक कोशिकाओं को जोड़ने और मुआवजे के रूप में पाठ में उल्लेख किया गया है के रूप में क्षतिपूर्ति ट्यूबों के लिए मुआवजे मोतियों जोड़ें. 35 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।फिर बर्फ के ठंडे HBSS के साथ ट्यूबों को भरने के बाद, 800 बार G.For मुआवजा ट्यूबों पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant aspirate के रूप में संभव के रूप में छर्रों के करीब के रूप में और छर्रों को ढीला करने के लिए झटका. इसके बाद, मुआवजे की ट्यूबों में ठंडे एचबीएसएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आवश्यक होने तक एक प्रकाश संरक्षित क्षेत्र में बर्फ पर ट्यूबों को स्टोर करें। फिर थूक unstained, आइसोटाइप, रक्त, और उपकला ट्यूबों से supernatant aspirate.ट्यूबों flicking द्वारा छर्रों ढीला. बिना दाग और आइसोटाइप ट्यूबों में 1% पीएफए के दो मिलीलीटर और रक्त और उपकला ट्यूबों में 10 मिलीलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए एक प्रकाश संरक्षित तरीके से बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, फिर अधिकतम गति से जल्दी से भंवर करें और फिर से एक और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।फिर बर्फ ठंडा HBSS के साथ ट्यूबों को भरें। इसके बाद, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, 600 बार G.Aspirate सेल पैलेट को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant और कोशिकाओं को ढीला करने के लिए उंगलियों के साथ ट्यूब को झटका दें, फिर बिना दाग और आइसोटाइप ट्यूबों में ठंडे एचबीएसएस के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। गणना करें और कुल सेल गिनती के अनुसार रक्त और उपकला ट्यूब के पुन: निलंबन के लिए HBSS की आवश्यक मात्रा जोड़ें।सभी नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर प्रकाश से संरक्षित क्षतिपूर्ति ट्यूबों में स्टोर करें जब तक कि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नहीं किया जाता है। उपयोग किए जा रहे प्रवाह साइटोमीटर के लिए उपयुक्त स्टार्टअप प्रक्रियाओं को लागू करें। राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान या NIST मोतियों के मिश्रण का उपयोग करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि आगे तितर बितर और साइड स्कैटर वोल्टेज को अक्षों के बहुत करीब मोतियों को रखे बिना भूखंड को फैलाने के लिए NIST मोतियों को रखने के लिए सेट किया गया है।LSRII के लिए मध्यम या Navios EX के लिए उच्च करने के लिए प्रवाह दर सेट करें। स्कैटर और फ्लोरोसेंट पैरामीटर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पैरामीटर के लिए वोल्टेज को समायोजित करें ताकि सेल आबादी को पैमाने पर रखा जा सके। तदनुसार वोल्टेज को समायोजित करने के लिए मार्गदर्शन के रूप में गेटिंग रणनीति के साथ आंकड़ों का उपयोग करें। पहले बिना दाग वाले थूक के नमूने के लिए डेटा प्राप्त करें, इसके बाद आइसोटाइप दाग वाले नमूने, और फिर रक्त ट्यूब और उपकला ट्यूब।थूक के वजन का उपयोग धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी या डाई वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए किया गया था। थूक वजन और सेल उपज के बीच सहसंबंध मजबूत नहीं था। थूक के नमूनों को चार वजन श्रेणियों में विभाजित किया गया था, जो सेल उपज के वितरण में क्लस्टर किया गया था।उपयोग किए गए प्रत्येक एंटीबॉडी को पठार चरण पर एक एकाग्रता में टिटरेट किया गया था, जिसमें उच्चतम धुंधला सूचकांक को काम करने वाली एकाग्रता के रूप में चुना गया था। सभी वजन श्रेणियों में, औसत एसईसी संदूषण दिखाया गया व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ 20% से कम था। प्रस्तुत किया गया विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति है।NIST मोतियों का उपयोग एक गेट सेट करने के लिए किया गया था जिसे मलबे को खत्म करने के लिए थूक के नमूने पर लागू किया गया था। चौड़ाई गेट द्वारा छोटे मलबे को और समाप्त कर दिया गया था। व्यवहार्यता डाई का उपयोग मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए किया गया था, जबकि सिंगल गेट ने डबल्स को हटा दिया था।एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी लेबलिंग ने लाइव सिंगल थूक कोशिकाओं को रक्त कोशिका और एक गैर-रक्त कोशिका डिब्बे में अलग करने की अनुमति दी। Navios EX, LSRII, और Lyric से प्राप्त प्रोफाइल की तुलना की गई थी। मलबे, मृत कोशिकाओं, डबल्स को खत्म करने और रक्त और गैर-रक्त प्रोफाइल की तुलना करने के लिए गेटिंग रणनीति दिखाई गई है।इस तकनीक ने हमें गैर-आक्रामक नैदानिक परीक्षण के रूप में उपयोग के लिए फेफड़ों के कैंसर के जोखिम का पता लगाने के लिए इन तरीकों को लागू करने की अनुमति दी।

Research

JoVE Journal

Medicine

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Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

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क्षणिक या स्थायी मस्तिष्क ischemia के मॉडल में ल्युकोसैट उप-जनसंख्या का Stereological और फ्लो विशेषता

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