Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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हम आंकड़े की तैयारी के साथ उनकी सहायता के लिए डेविड रोड्रिगेज को धन्यवाद देना चाहते हैं। थूक के नमूने यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सुविधा में बीडी एलएसआर II पर चलाए गए थे, जो यूटी हेल्थ, एनआईएच-एनसीआई पी 30 सीए054174-20 (यूटी हेल्थ में सीटीआरसी) और यूएल 1 टीआर 001120 (सीटीएसए अनुदान) द्वारा समर्थित था।

थूक प्रसंस्करण के सभी चरणों को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणके साथ एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है।
1. थूक पृथक्करण शुरू करने से पहले अभिकर्मक तैयारी
<ol><li>1% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफ...

थूक की सेलुलर सामग्री में व्यापक कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता शामिल है, जो अक्सर बहुत सारे मलबे के साथ होती है37। इसके अलावा, थूक विश्लेषण के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता होती है जो पुष्ट...

प्रवाह साइटोमीटर के हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में तकनीकी प्रगति ने एक साथ कई अलग-अलग सेल आबादी की पहचान करना संभव बना दिया है1,2,3,4। हेमटोपोइएटिक सेल अनुसंधान में प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली 2 और हेमटोपोइएटिक सिस्टम 5 के सेलुलर पदानुक्रम की बेहतर समझ के साथ-साथ विभिन्न रक्त कैंसर की भीड़ के नैदानिक अंतर को जन्म दिया है6,7,8। यद्यपि अधिकांश थूक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक मूल की हैं9,10,11, फ्लो साइटोमेट्री को नैदानिक उद्देश्यों के लिए थूक विश्लेषण पर व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है। हालांकि, कई अध्ययनों से पता चलता है कि थूक (कोशिकाओं का सबसे महत्वपूर्ण सबसेट) में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का मूल्यांकन अस्थमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 12,13,14,15 जैसी बीमारियों के निदान और / या निगरानी में बहुत मदद कर सकता है। इसके अलावा, उपकला-विशिष्ट मार्करों का अस्तित्व जो प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किया जा सकता है, थूक, फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं में कोशिकाओं के निम्नलिखित सबसे महत्वपूर्ण सबसेट की पूछताछ की अनुमति देता है।
विभिन्न ऊतक मूल के कई अलग-अलग सेल आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता के अलावा, एक प्रवाह साइटोमीटर अपेक्षाकृत कम अवधि में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का मूल्यांकन कर सकता है। इसकी तुलना में, स्लाइड-आधारित, साइटोलॉजिकल प्रकार के विश्लेषणों के लिए अक्सर अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों और / या उपकरणों की आवश्यकता होती है। ये विश्लेषण श्रम-गहन हो सकते हैं, जो थूक के नमूने का केवल एक अनुपात विश्लेषण किया जा रहा है16 की ओर जाता है।
तीन महत्वपूर्ण मुद्दे प्रवाह साइटोमेट्री में थूक के व्यापक उपयोग को सीमित करते हैं। पहला मुद्दा थूक के संग्रह से संबंधित है। थूक को एक हफ खांसी के माध्यम से एकत्र किया जाता है जो फेफड़ों से बलगम को मौखिक गुहा में निष्कासित करता है, बाद में एक संग्रह कप में थूकता है। चूंकि बलगम मौखिक गुहा के माध्यम से यात्रा करता है, इसलिए एसईसी संदूषण की एक उच्च संभावना है। यह संदूषण नमूना विश्लेषण को जटिल बनाता है, लेकिन समस्या को आसानी से एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर ठीक कर दिया जाता है, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है।
हर कोई अनायास थूक का उत्पादन नहीं कर सकता है; इसलिए, कई उपकरणों को एक गैर-आक्रामक तरीके से थूक संग्रह के साथ सहायता करने के लिए विकसित किया गया है17। नेबुलाइज़र एक ऐसा उपकरण है और इसे विश्वसनीय थूक के नमूनों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है18,19,20। हालांकि नेबुलाइज़र गैर-आक्रामक रूप से थूक एकत्र करने का एक बहुत ही प्रभावी तरीका है, इसके उपयोग के लिए अभी भी विशेष कर्मियों के साथ एक चिकित्सा सुविधा में एक सेटिंग की आवश्यकता होती है21। इसके विपरीत, फेफड़ों की बांसुरी 22,23,24 और एकापेला 16,25 जैसे हैंडहेल्ड उपकरणों का उपयोग घर पर किया जा सकता है क्योंकि वे बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं। ये सहायता उपकरण दोनों सुरक्षित और लागत प्रभावी हैं।
हमारे लिए, अकापेला ने फेफड़ों की बांसुरी 16 की तुलना में लगातार बेहतर परिणाम दिए, और इसलिए, एकापेला डिवाइस को थूक संग्रह के लिए चुना गया है। एक 3-दिवसीय संग्रह नमूना तय किया गया था क्योंकि थूक का उपयोग करने का प्राथमिक उद्देश्य फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने वाले परीक्षण 16 को विकसित करना है। यह दिखाया गया है कि 3-दिवसीय नमूना 1- या 2-दिवसीय नमूने 26,27,28 की तुलना में फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है। हालांकि, थूक संग्रह के अन्य तरीके विभिन्न उद्देश्यों के लिए बेहतर हो सकते हैं। यदि यहां वर्णित एक की तुलना में एक अलग थूक संग्रह विधि का उपयोग किया जाता है, तो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी या डाई को सावधानीपूर्वक टाइटरेट करने की सिफारिश की जाती है; बहुत कम डेटा उपलब्ध है कि विभिन्न थूक संग्रह विधियां प्रवाह साइटोमेट्री के लिए लक्षित प्रोटीन को कैसे प्रभावित करती हैं।
निदान के लिए थूक का उपयोग करने के लिए उत्साह को कम करने वाला दूसरा मुद्दा, मुख्य रूप से प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित है, सेल संख्या है। समस्या एक विश्वसनीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं का संग्रह है। दो अध्ययनों से पता चला है कि गैर-इनवेसिव तरीकों द्वारा एकत्र किए गए थूक के नमूनों में, एक सहायता उपकरण की मदद से, पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाएं होती हैं जिनका उपयोग नैदानिक निदान या अनुसंधान अध्ययनों में किया जा सकता है16,24। हालांकि, इन अध्ययनों में से किसी ने भी प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित सेल संख्याओं के मुद्दे को संबोधित नहीं किया।
इस प्रोटोकॉल के लिए आधार बनाने वाले अध्ययनों के लिए, प्रत्येक अध्ययन स्थल के लिए अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए फेफड़ों के कैंसर के विकास के लिए उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों से थूक के नमूने एकत्र किए गए थे। उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों को 55-75 वर्षों के बीच के रूप में परिभाषित किया गया था, जिन्होंने 30 पैक-वर्षों में धूम्रपान किया था और पिछले 15 वर्षों के भीतर धूम्रपान नहीं छोड़ा था। रोगियों को दिखाया गया था कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार एकापेला डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए29 और घर पर लगातार तीन दिनों तक थूक एकत्र किया गया। नमूने को अंतिम संग्रह तक रेफ्रिजरेटर में रखा गया था। अंतिम संग्रह के दिन, नमूने को एक जमे हुए ठंडे पैक के साथ रात भर प्रयोगशाला में भेज दिया गया था। नमूनों को उस दिन एक एकल सेल निलंबन में संसाधित किया गया था जिस दिन वे प्राप्त हुए थे। थूक संग्रह की इस विधि के साथ, एक विश्वसनीय प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं से अधिक प्राप्त किया जाता है।
अंत में, और पिछले सेल नंबर मुद्दे से संबंधित, यह सवाल है कि थूक कोशिकाओं को इसके म्यूकिनस वातावरण से कैसे जारी किया जाए। कोशिकाओं को व्यवहार्य कैसे रखा जा सकता है और एक एकल सेल निलंबन बनाया जा सकता है जो प्रवाह साइटोमीटर को रोक नहींता है? Pizzichini et al.30 और Miller et al.31 द्वारा प्रारंभिक काम के आधार पर, यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक प्रसंस्करण के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है जो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इस विधि ने थूक में हेमटोपोइएटिक और उपकला कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक कुशल एंटीबॉडी लेबलिंग रणनीति विकसित करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर थूक विश्लेषण को मानकीकृत करने वाले उपकरण सेटिंग्स, गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और विश्लेषण दिशानिर्देशों को प्रदान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री 32,33,34 में अच्छी तरह से स्थापित दिशानिर्देशों का उपयोग किया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

थूक, व्यापक रूप से फेफड़ों के स्वास्थ्य को समझने के लिए सेलुलर सामग्री और अन्य माइक्रोएनवायरमेंटल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, पारंपरिक रूप से साइटोलॉजी-आधारित तरीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। इसकी उपयोगिता सीमित है क्योंकि स्लाइड पढ़ना समय लेने वाला है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, व्यापक मलबे और बहुत अधिक स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (एसईसी), या गाल कोशिकाओं की उपस्थिति, अक्सर निदान के लिए अपर्याप्त नमूना प्रदान करती है। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर आबादी के उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि एक साथ मलबे और एसईसी को छोड़कर।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन, एंटीबॉडी दाग और सेलुलर आबादी को ठीक करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर नमूने प्राप्त करने के लिए थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। एक गेटिंग रणनीति जो मलबे, मृत कोशिकाओं (एसईसी सहित) और सेल डबल्स के बहिष्करण का वर्णन करती है, यहां प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यह काम यह भी बताता है कि हेमटोपोइएटिक और उपकला वंश के सबसेट को चिह्नित करने के लिए भेदभाव (सीडी) 45 सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के एक समूह के आधार पर व्यवहार्य, एकल थूक कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए। एक गुणवत्ता नियंत्रण उपाय भी सबूत के रूप में फेफड़ों-विशिष्ट मैक्रोफेज की पहचान करके प्रदान किया जाता है कि एक नमूना फेफड़ों से प्राप्त होता है और लार नहीं होता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस विधि को तीन प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण किए गए एक ही रोगी से थूक प्रोफाइल प्रदान करके विभिन्न साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है; Navios पूर्व, LSR द्वितीय, और गीत. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को ब्याज के अतिरिक्त सेलुलर मार्करों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफ़ॉर्म पर एक पूरे थूक के नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो थूक को फेफड़ों की बीमारी के उच्च-थ्रूपुट निदान के विकास के लिए उपयुक्त बनाती है।

इस प्रोटोकॉल को एक नैदानिक प्रयोगशाला सेटिंग को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया था। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान ध्यान सादगी, दक्षता और पुनरुत्पादन पर था। यह पाया गया कि थूक के प्रसंस्करण में सबसे अ?...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है और मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर सेलुलर सबसेट के बाद के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता-नियंत्रित थूक विश्लेषण

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

यह प्रोटोकॉल थूक प्रसंस्करण के साथ अनुभव की गई सामान्य चुनौतियों को हल करता है जिसने अतीत में उच्च-थ्रूपुट नैदानिक नैदानिक उद्देश्यों के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के साथ उपयोग करना मुश्किल बना दिया है। इस प्रोटोकॉल को एंटीबॉडी और डाई स्टेनिंग वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए थूक वजन का उपयोग करके समय बचाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। धुंधला इनक्यूबेशन के दौरान, डाउनस्ट्रीम चरणों के लिए सेल काउंट किया जा सकता है।प्रवाह साइटोमीटर पर चलते समय किसी भी समस्या को रोकने के लिए सही पुन: निलंबन मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सटीक सेल गिनती प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल फेफड़ों के स्वास्थ्य की जांच करने वाले अनुसंधान के क्षेत्रों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, सीओपीडी, अस्थमा, फेफड़ों के कैंसर जैसी बीमारियों या कोविड के प्रभावों का अध्ययन किया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ माइकल लाई, मेरी प्रयोगशाला से एक अनुसंधान और विकास वैज्ञानिक होगा। शुरू करने के लिए, पृथक्करण अभिकर्मकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए थूक के नमूने का वजन करें। नमूने को थूक के वजन के आधार पर उचित आकार के पोत में स्थानांतरित करें, फिर 0.5% एनएसी के प्रति ग्राम एक मिलीलीटर और 0.1% डीटीटी के प्रति ग्राम चार मिलीलीटर जोड़ें।भंवर 15 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर नमूनों और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर रॉक। एनएसी और डीटीटी को बेअसर करने के लिए 4X हैंक्स संतुलित नमक समाधान या एचबीएसएस के साथ इस नमूने को पतला करें। और त्वरित भंवर के बाद, पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को रॉक करें।एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक या अधिक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक 100 माइक्रोमीटर नायलॉन जाल सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें। कोशिकाओं के नीचे गोली. supernatant aspirating के बाद, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में छर्रों गठबंधन और एक ही शर्तों के तहत HBSS के साथ धोना।थूक के नमूने के प्रारंभिक वजन द्वारा निर्धारित बफर की मात्रा में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन से एक ऐलीकोट लें और 0.4% ट्रिपैन नीले रंग के 30 माइक्रोलीटर के साथ थूक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोलीटर को मिलाएं, फिर एक जीवित / मृत सेल गिनती के लिए हेमोसाइटोमीटर के गिनती कक्षों में लोड करें। क्षतिपूर्ति ट्यूबों में थूक लेबल.प्रत्येक थूक सेल ट्यूब और क्षतिपूर्ति ट्यूब के लिए HBSS एंटीबॉडी और डाई जोड़ें जैसा कि पाठ में इंगित किया गया है। परख ट्यूबों के लिए थूक कोशिकाओं को जोड़ने और मुआवजे के रूप में पाठ में उल्लेख किया गया है के रूप में क्षतिपूर्ति ट्यूबों के लिए मुआवजे मोतियों जोड़ें. 35 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।फिर बर्फ के ठंडे HBSS के साथ ट्यूबों को भरने के बाद, 800 बार G.For मुआवजा ट्यूबों पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant aspirate के रूप में संभव के रूप में छर्रों के करीब के रूप में और छर्रों को ढीला करने के लिए झटका. इसके बाद, मुआवजे की ट्यूबों में ठंडे एचबीएसएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आवश्यक होने तक एक प्रकाश संरक्षित क्षेत्र में बर्फ पर ट्यूबों को स्टोर करें। फिर थूक unstained, आइसोटाइप, रक्त, और उपकला ट्यूबों से supernatant aspirate.ट्यूबों flicking द्वारा छर्रों ढीला. बिना दाग और आइसोटाइप ट्यूबों में 1% पीएफए के दो मिलीलीटर और रक्त और उपकला ट्यूबों में 10 मिलीलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए एक प्रकाश संरक्षित तरीके से बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, फिर अधिकतम गति से जल्दी से भंवर करें और फिर से एक और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।फिर बर्फ ठंडा HBSS के साथ ट्यूबों को भरें। इसके बाद, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, 600 बार G.Aspirate सेल पैलेट को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant और कोशिकाओं को ढीला करने के लिए उंगलियों के साथ ट्यूब को झटका दें, फिर बिना दाग और आइसोटाइप ट्यूबों में ठंडे एचबीएसएस के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। गणना करें और कुल सेल गिनती के अनुसार रक्त और उपकला ट्यूब के पुन: निलंबन के लिए HBSS की आवश्यक मात्रा जोड़ें।सभी नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर प्रकाश से संरक्षित क्षतिपूर्ति ट्यूबों में स्टोर करें जब तक कि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नहीं किया जाता है। उपयोग किए जा रहे प्रवाह साइटोमीटर के लिए उपयुक्त स्टार्टअप प्रक्रियाओं को लागू करें। राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान या NIST मोतियों के मिश्रण का उपयोग करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि आगे तितर बितर और साइड स्कैटर वोल्टेज को अक्षों के बहुत करीब मोतियों को रखे बिना भूखंड को फैलाने के लिए NIST मोतियों को रखने के लिए सेट किया गया है।LSRII के लिए मध्यम या Navios EX के लिए उच्च करने के लिए प्रवाह दर सेट करें। स्कैटर और फ्लोरोसेंट पैरामीटर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पैरामीटर के लिए वोल्टेज को समायोजित करें ताकि सेल आबादी को पैमाने पर रखा जा सके। तदनुसार वोल्टेज को समायोजित करने के लिए मार्गदर्शन के रूप में गेटिंग रणनीति के साथ आंकड़ों का उपयोग करें। पहले बिना दाग वाले थूक के नमूने के लिए डेटा प्राप्त करें, इसके बाद आइसोटाइप दाग वाले नमूने, और फिर रक्त ट्यूब और उपकला ट्यूब।थूक के वजन का उपयोग धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी या डाई वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए किया गया था। थूक वजन और सेल उपज के बीच सहसंबंध मजबूत नहीं था। थूक के नमूनों को चार वजन श्रेणियों में विभाजित किया गया था, जो सेल उपज के वितरण में क्लस्टर किया गया था।उपयोग किए गए प्रत्येक एंटीबॉडी को पठार चरण पर एक एकाग्रता में टिटरेट किया गया था, जिसमें उच्चतम धुंधला सूचकांक को काम करने वाली एकाग्रता के रूप में चुना गया था। सभी वजन श्रेणियों में, औसत एसईसी संदूषण दिखाया गया व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ 20% से कम था। प्रस्तुत किया गया विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति है।NIST मोतियों का उपयोग एक गेट सेट करने के लिए किया गया था जिसे मलबे को खत्म करने के लिए थूक के नमूने पर लागू किया गया था। चौड़ाई गेट द्वारा छोटे मलबे को और समाप्त कर दिया गया था। व्यवहार्यता डाई का उपयोग मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए किया गया था, जबकि सिंगल गेट ने डबल्स को हटा दिया था।एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी लेबलिंग ने लाइव सिंगल थूक कोशिकाओं को रक्त कोशिका और एक गैर-रक्त कोशिका डिब्बे में अलग करने की अनुमति दी। Navios EX, LSRII, और Lyric से प्राप्त प्रोफाइल की तुलना की गई थी। मलबे, मृत कोशिकाओं, डबल्स को खत्म करने और रक्त और गैर-रक्त प्रोफाइल की तुलना करने के लिए गेटिंग रणनीति दिखाई गई है।इस तकनीक ने हमें गैर-आक्रामक नैदानिक परीक्षण के रूप में उपयोग के लिए फेफड़ों के कैंसर के जोखिम का पता लगाने के लिए इन तरीकों को लागू करने की अनुमति दी।

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JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

मानव सीरम में एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर या dopamine का 2 रिसेप्टर के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उच्च throughput फ्लो सेल आधारित परख

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

नैदानिक ​​और preclinical अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए ट्यूमर सेल (सीटीसी) Assays घूम semiautomated का अनुकूलन

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

संग्रह, अलगाव, और मानव endocervical नमूने का प्रवाह cytometric विश्लेषण

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

क्षणिक या स्थायी मस्तिष्क ischemia के मॉडल में ल्युकोसैट उप-जनसंख्या का Stereological और फ्लो विशेषता

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

आण्विक जांच अनुकूलन (संश्लेषक जीव में सेल मृत्यु दर निर्धारित करने के लिए<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) फ्लो का प्रयोग

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- और फ्लो के आधार पर सेल की स्थिति का विश्लेषण और 3 डी मेलेनोमा spheroids में कोशिका चक्र

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

थूक प्रेरण और प्रयोगशाला प्रसंस्करण के लिए क्रियाविधि

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

प्रवाह Cytometry का उपयोग करके मानव वसा ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का लक्षण वर्णन

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन के बाद कार्डियक Myocytes में Mitochondrial झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए एक प्रवाह Cytometry-आधारित परख

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.