Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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Vogliamo ringraziare David Rodriguez per la sua assistenza nella preparazione della figura. I campioni di espettorato sono stati eseguiti sul BD LSR II presso l'UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, supportati da UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (sovvenzione CTSA).

Tutte le fasi della lavorazione dell'espettorato vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale.
1. Preparazione del reagente prima di iniziare la dissociazione dell'espettorato
<ol><li>Scongelare l'1% di paraformaldeide (PFA), 25 ml per campione su ghiaccio e mantenere freddo fino all'uso. ATTENZIONE: il PFA è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Preparare il fissativo secondo le istruzioni del produttore e congelare a...

Il contenuto cellulare dell'espettorato comprende una grande varietà di cellule ad ampio raggio, spesso accompagnate da molti detriti37. Inoltre, l'analisi dell'espettorato richiede un controllo di qualità che confermi che il campione viene raccolto dal polmone anziché dalla cavità orale38. Pertanto, non è così semplice analizzare l'espettorato mediante citometria a flusso come lo è per il sangue, ad esempio, che rilascia una sospensione cellulare molto più pulita e...

I progressi tecnici nell'hardware e nel software dei citometri a flusso hanno permesso di identificare contemporaneamente molte popolazioni cellulari distinte1,2,3,4. L'utilizzo del citometro a flusso nella ricerca sulle cellule ematopoietiche, ad esempio, ha portato a una comprensione molto migliore del sistema immunitario2 e della gerarchia cellulare del sistema ematopoietico5, nonché alla distinzione diagnostica di una moltitudine di diversi tumori del sangue6,7,8. Sebbene la maggior parte delle cellule dell'espettorato siano di origine ematopoietica9,10,11, la citometria a flusso non è stata ampiamente applicata all'analisi dell'espettorato a fini diagnostici. Tuttavia, diversi studi suggeriscono che la valutazione delle popolazioni di cellule immunitarie nell'espettorato (il sottoinsieme più significativo di cellule) può essere di grande aiuto nella diagnosi e / o nel monitoraggio di malattie come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)12,13,14,15. Inoltre, l'esistenza di marcatori epiteliali specifici che possono essere utilizzati nella citometria a flusso consente l'interrogazione del seguente sottoinsieme più significativo di cellule nell'espettorato, cellule epiteliali polmonari.
Oltre alla capacità di analizzare molte popolazioni cellulari distinte di diverse origini tissutali, un citometro a flusso può valutare un gran numero di cellule in un periodo relativamente breve. In confronto, i tipi di analisi citologiche basate su diapositive spesso richiedono personale e/o attrezzature altamente specializzati. Queste analisi possono essere laboriose, il che porta all'analisi solo di una parte del campione di espettorato16.
Tre criticità limitano l'uso diffuso dell'espettorato nella citometria a flusso. La prima questione riguarda la raccolta dell'espettorato. L'espettorato viene raccolto attraverso una tosse che espelle il muco dai polmoni nella cavità orale, sputando successivamente in una tazza di raccolta. Poiché il muco viaggia attraverso la cavità orale, c'è un'alta probabilità di contaminazione SEC. Questa contaminazione complica l'analisi del campione, ma il problema è facilmente risolvibile su una piattaforma citometrica a flusso, come mostrato in questo studio.
Non tutti possono produrre espettorato spontaneamente; pertanto, sono stati sviluppati diversi dispositivi per aiutare con la raccolta dell'espettorato in modo non invasivo17. Il nebulizzatore è uno di questi dispositivi e ha dimostrato di produrre campioni di espettorato affidabili18,19,20. Sebbene il nebulizzatore sia un modo molto efficace per raccogliere in modo non invasivo l'espettorato, il suo utilizzo richiede comunque un ambiente in una struttura medica con personale specializzato21. Al contrario, dispositivi portatili come il flauto polmonare22,23,24 e l'acapella16,25 possono essere utilizzati a casa poiché sono molto user-friendly. Questi dispositivi di assistenza sono sicuri ed economici.
Per noi, l'acapella ha dato risultati costantemente migliori rispetto al flauto polmonare16 e, pertanto, il dispositivo a cappella è stato scelto per le collezioni di espettorato. È stato deciso un campione di raccolta di 3 giorni perché lo scopo principale per l'utilizzo dell'espettorato è quello di sviluppare un test di rilevamento del cancro del polmone16. È stato dimostrato che un campione di 3 giorni aumenta la probabilità di rilevamento del cancro del polmone rispetto a un campione di 1 o 2 giorni26,27,28. Tuttavia, altri metodi di raccolta dell'espettorato possono essere preferibili per scopi diversi. Se si utilizza un metodo di raccolta dell'espettorato diverso da quello qui descritto, si raccomanda di titolare attentamente ogni anticorpo o colorante utilizzato per l'analisi citometrica a flusso; sono disponibili pochissimi dati su come i diversi metodi di raccolta dell'espettorato influenzano le proteine mirate per la citometria a flusso.
Il secondo problema che smorza l'entusiasmo per l'uso dell'espettorato per la diagnostica, principalmente legato alla citometria a flusso, è il numero di cellule. Il problema è la raccolta di cellule vitali sufficienti per un'analisi affidabile. Due studi hanno dimostrato che i campioni di espettorato raccolti con metodi non invasivi, con l'aiuto di un dispositivo di assistenza, contengono abbastanza cellule vitali che possono essere utilizzate nella diagnosi clinica o negli studi di ricerca16,24. Tuttavia, nessuno di questi studi ha affrontato il problema del numero di cellule per quanto riguarda la citometria a flusso.
Per gli studi che costituiscono la base di questo protocollo, sono stati raccolti campioni di espettorato da partecipanti ad alto rischio di sviluppare il cancro del polmone seguendo le linee guida istituzionali approvate per ciascun sito di studio. I partecipanti ad alto rischio sono stati definiti come tra 55-75 anni, avendo fumato 30 anni e non avendo smesso di fumare negli ultimi 15 anni. Ai pazienti è stato mostrato come utilizzare il dispositivo a cappella secondo le istruzioni del produttore29 e hanno raccolto l'espettorato per tre giorni consecutivi a casa. Il campione è stato conservato in frigorifero fino all'ultima raccolta. L'ultimo giorno di raccolta, il campione è stato spedito al laboratorio durante la notte con un pacco freddo congelato. I campioni sono stati elaborati in una sospensione a cella singola il giorno in cui sono stati ricevuti. Con questo metodo di raccolta dell'espettorato, si ottengono più che sufficienti cellule vitali per un'analisi citometrica a flusso affidabile.
Infine, e in relazione al precedente problema del numero di cellule, è la questione di come rilasciare le cellule dell'espettorato dal suo ambiente mucinoso. Come si possono mantenere vitali le cellule e creare una sospensione monocellulare che non ostruisca il citometro a flusso? Basato sul lavoro iniziale di Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, questo protocollo descrive un metodo semplice e affidabile per l'elaborazione dell'espettorato in una sospensione a singola cellula adatta per l'analisi citometrica a flusso. Questo metodo ha utilizzato linee guida consolidate nella citometria a flusso32,33,34 per sviluppare un'efficiente strategia di etichettatura degli anticorpi per identificare le cellule ematopoietiche ed epiteliali nell'espettorato e fornire impostazioni dello strumento, misure di controllo della qualità e linee guida di analisi che standardizzano l'analisi dell'espettorato su una piattaforma citometrica a flusso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

L'espettorato, ampiamente utilizzato per studiare il contenuto cellulare e altre caratteristiche microambientali per comprendere la salute del polmone, viene tradizionalmente analizzato utilizzando metodologie basate sulla citologia. La sua utilità è limitata perché la lettura delle diapositive richiede molto tempo e richiede personale altamente specializzato. Inoltre, detriti estesi e la presenza di troppe cellule epiteliali squamose (VEC), o cellule della guancia, spesso rendono un campione inadeguato per la diagnosi. Al contrario, la citometria a flusso consente la fenotipizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari escludendo contemporaneamente detriti e SEC.
Il protocollo qui presentato descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula, colorare anticorpi e fissare popolazioni cellulari e acquisire campioni su una piattaforma citometrica a flusso. Una strategia di gating che descrive l'esclusione di detriti, cellule morte (compresi i SEC) e doppietti cellulari è presentata qui. Inoltre, questo lavoro spiega anche come analizzare le cellule vitali e singole dell'espettorato basate su un gruppo di differenziazione (CD)45 popolazioni positive e negative per caratterizzare i sottoinsiemi di lignaggio ematopoietico ed epiteliale. Una misura di controllo della qualità viene fornita anche identificando macrofagi polmonari specifici come prova che un campione è derivato dal polmone e non è saliva. Infine, è stato dimostrato che questo metodo può essere applicato a diverse piattaforme citometriche fornendo profili espettorati dello stesso paziente analizzati su tre citometri a flusso; Navios EX, LSR II e Lyric. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per includere ulteriori marcatori cellulari di interesse. Qui viene presentato un metodo per analizzare un intero campione di espettorato su una piattaforma citometrica a flusso che rende l'espettorato suscettibile di sviluppare diagnostica ad alto rendimento della malattia polmonare.

Questo protocollo è stato sviluppato pensando a un ambiente di laboratorio clinico. Durante lo sviluppo del protocollo ci si è concentrati sulla semplicità, l'efficienza e la riproducibilità. Si è scoperto che la fase più dispendiosa in termini di tempo nell'elaborazione dell'espettorato era il conteggio delle cellule. Pertanto, il protocollo è impostato in modo tale che l'elaborazione dell'espettorato e l'etichettatura delle cellule possano essere eseguite indipendentemente dal conteggio delle cellule senza perdi...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.

Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Questo protocollo risolve le sfide comuni riscontrate con l'elaborazione dell'espettorato che hanno reso difficile in passato l'uso con la citometria a flusso per scopi diagnostici clinici ad alto rendimento. Questo protocollo è progettato per risparmiare tempo utilizzando il peso dell'espettorato per determinare i volumi di colorazione di anticorpi e coloranti. Durante l'incubazione della colorazione, il conteggio delle cellule può essere eseguito per le fasi a valle.È importante ottenere un conteggio cellulare accurato per determinare il corretto volume di risospensione per prevenire eventuali problemi durante l'esecuzione sul citometro a flusso. Questo protocollo può fornire informazioni sulle aree di ricerca che studiano la salute dei polmoni. Ad esempio, potrebbero essere studiate malattie come la BPCO, l'asma, il cancro ai polmoni o gli effetti del COVID.A dimostrare la procedura sarà il Dr.Michael Lai, uno scienziato di ricerca e sviluppo del mio laboratorio. Per cominciare, pesare il campione di espettorato per determinare i volumi di reagenti di dissociazione. Trasferire il campione al recipiente di dimensioni appropriate in base al peso dell'espettorato, quindi aggiungere un millilitro per grammo dello 0,5% NAC e quattro millilitri per grammo dello 0,1% DTT.Vortice i campioni alla massima velocità per 15 secondi e oscilla alla massima velocità per 15 minuti a temperatura ambiente. Diluire questo campione con soluzione salina bilanciata 4X Hanks o HBSS per neutralizzare il NAC e il DTT. E dopo un rapido vortice, scuotere il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 100 micrometri in uno o più tubi centrifughici conici da 50 millilitri per creare una sospensione a cella singola. Pellet giù per le celle. Dopo aver aspirato il surnatante, combinare i pellet in un tubo conico da 15 millilitri e lavare con HBSS nelle stesse condizioni.Risospesso il pellet cellulare in un volume di tampone determinato dal peso iniziale del campione di espettorato. Prendere un'aliquota dalla sospensione cellulare e mescolare 10 microlitri della diluizione dell'espettorato con 30 microlitri di blu tripano allo 0,4%, quindi caricare nelle camere di conteggio di un emocitometro per un conteggio delle cellule vive / morte. Etichettare l'espettorato nei tubi di compensazione.Aggiungere l'anticorpo HBSS e il colorante a ciascun tubo cellulare dell'espettorato e ai tubi di compensazione come indicato nel testo. Aggiungere le cellule dell'espettorato ai tubi di analisi e aggiungere perline di compensazione ai tubi di compensazione come menzionato nel testo. Incubare tutti i tubi sul ghiaccio protetti dalla luce per 35 minuti.Quindi, dopo aver riempito i tubi con HBSS ghiacciato, centrifugare a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 800 volte G.Per i tubi di compensazione, aspirare il surnatante il più vicino possibile al pellet e far scorrere il pellet per allentare. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di HBSS freddo ai tubi di compensazione e conservare i tubi sul ghiaccio in un'area protetta dalla luce fino a quando non è necessario per l'analisi della citometria a flusso. Quindi aspirare il surnatante dall'espettorato non macchiato, dall'isotipo, dal sangue e dai tubi epiteliali.Allentare i pellet facendo scorrere i tubi. Aggiungere due millilitri di 1% PFA ai tubi non macchiati e isotipici e 10 millilitri ai tubi del sangue e dell'epitelio. Incubare i tubi sul ghiaccio in modo protetto dalla luce per 30 minuti, quindi ruotare rapidamente alla massima velocità e incubare di nuovo per altri 30 minuti.Quindi riempire i tubi con HBSS ghiacciato. Successivamente, centrifugare i tubi a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.600 volte G.Aspirare il più possibile surnatante senza disturbare il pellet cellulare e far scorrere il tubo con le dita per allentare le cellule, quindi aggiungere 200 microlitri di HBSS freddo ai tubi non macchiati e isotipi. Calcolare e aggiungere il volume richiesto di HBSS per la risospensione del sangue e del tubo epiteliale in base al numero totale di cellule.Conservare tutti i campioni in provette di compensazione protette dalla luce sul ghiaccio a quattro gradi Celsius fino all'esecuzione dell'analisi citometrica a flusso. Applicare procedure di avvio appropriate per il citometro a flusso utilizzato. Utilizzare la miscela di perline del National Institute of Standards and Technology o del NIST per garantire che le tensioni di dispersione diretta e di dispersione laterale siano impostate per posizionare le perle NIST per coprire la trama senza posizionare le perline troppo vicino agli assi.Impostare la portata su media per LSRII o alta per Navios EX. Regolare le tensioni per ciascun parametro utilizzato per i parametri scatter e fluorescenti per posizionare le popolazioni cellulari su scala. Usa le figure con la strategia di gating come guida per regolare le tensioni di conseguenza. Acquisire prima i dati per il campione di espettorato non macchiato, seguito dal campione colorato con isotipo, quindi dalla sonda sanguigna e dalla tuba epiteliale.Il peso dell'espettorato è stato utilizzato per determinare i volumi di anticorpi o coloranti per la colorazione. La correlazione tra peso dell'espettorato e resa cellulare non era forte. I campioni di espettorato sono stati divisi in quattro categorie di peso, che si sono raggruppate nella distribuzione della resa cellulare.Ogni anticorpo utilizzato è stato titolato in una concentrazione nella fase di plateau con il più alto indice di colorazione è stato scelto come concentrazione di lavoro. In tutte le categorie di peso, la contaminazione media da SEC era inferiore al 20% con la percentuale di cellule vitali mostrate. Viene presentata la strategia di gating utilizzata per l'analisi.Le perle del NIST sono state utilizzate per impostare un cancello che è stato applicato al campione di espettorato per eliminare i detriti. Piccoli detriti sono stati ulteriormente eliminati dal cancello largo. Il colorante di vitalità è stato utilizzato per eliminare le cellule morte, mentre il cancello del singoletto ha rimosso i doppietti.L'etichettatura degli anticorpi anti-CD45 ha permesso la separazione di singole cellule espettorato vive in una cellula del sangue e in un compartimento non di cellule del sangue. I profili ottenuti da Navios EX, LSRII e Lyric sono stati confrontati. Viene mostrata la strategia di gating per eliminare i detriti, le cellule morte, i doppietti e confrontare i profili di sangue e non sangue.Questa tecnica ci ha permesso di applicare questi metodi per rilevare il rischio di cancro al polmone da utilizzare come test clinico non invasivo.

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