Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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Vogliamo ringraziare David Rodriguez per la sua assistenza nella preparazione della figura. I campioni di espettorato sono stati eseguiti sul BD LSR II presso l'UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, supportati da UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (sovvenzione CTSA).

Tutte le fasi della lavorazione dell'espettorato vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale.
1. Preparazione del reagente prima di iniziare la dissociazione dell'espettorato
<ol><li>Scongelare l'1% di paraformaldeide (PFA), 25 ml per campione su ghiaccio e mantenere freddo fino all'uso. ATTENZIONE: il PFA è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Preparare il fissativo secondo le istruzioni del produttore e congelare a...

Il contenuto cellulare dell'espettorato comprende una grande varietà di cellule ad ampio raggio, spesso accompagnate da molti detriti37. Inoltre, l'analisi dell'espettorato richiede un controllo di qualità che confermi che il campione viene raccolto dal polmone anziché dalla cavità orale38. Pertanto, non è così semplice analizzare l'espettorato mediante citometria a flusso come lo è per il sangue, ad esempio, che rilascia una sospensione cellulare molto più pulita e...

I progressi tecnici nell'hardware e nel software dei citometri a flusso hanno permesso di identificare contemporaneamente molte popolazioni cellulari distinte1,2,3,4. L'utilizzo del citometro a flusso nella ricerca sulle cellule ematopoietiche, ad esempio, ha portato a una comprensione molto migliore del sistema immunitario2 e della gerarchia cellulare del sistema ematopoietico5, nonché alla distinzione diagnostica di una moltitudine di diversi tumori del sangue6,7,8. Sebbene la maggior parte delle cellule dell'espettorato siano di origine ematopoietica9,10,11, la citometria a flusso non è stata ampiamente applicata all'analisi dell'espettorato a fini diagnostici. Tuttavia, diversi studi suggeriscono che la valutazione delle popolazioni di cellule immunitarie nell'espettorato (il sottoinsieme più significativo di cellule) può essere di grande aiuto nella diagnosi e / o nel monitoraggio di malattie come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)12,13,14,15. Inoltre, l'esistenza di marcatori epiteliali specifici che possono essere utilizzati nella citometria a flusso consente l'interrogazione del seguente sottoinsieme più significativo di cellule nell'espettorato, cellule epiteliali polmonari.
Oltre alla capacità di analizzare molte popolazioni cellulari distinte di diverse origini tissutali, un citometro a flusso può valutare un gran numero di cellule in un periodo relativamente breve. In confronto, i tipi di analisi citologiche basate su diapositive spesso richiedono personale e/o attrezzature altamente specializzati. Queste analisi possono essere laboriose, il che porta all'analisi solo di una parte del campione di espettorato16.
Tre criticità limitano l'uso diffuso dell'espettorato nella citometria a flusso. La prima questione riguarda la raccolta dell'espettorato. L'espettorato viene raccolto attraverso una tosse che espelle il muco dai polmoni nella cavità orale, sputando successivamente in una tazza di raccolta. Poiché il muco viaggia attraverso la cavità orale, c'è un'alta probabilità di contaminazione SEC. Questa contaminazione complica l'analisi del campione, ma il problema è facilmente risolvibile su una piattaforma citometrica a flusso, come mostrato in questo studio.
Non tutti possono produrre espettorato spontaneamente; pertanto, sono stati sviluppati diversi dispositivi per aiutare con la raccolta dell'espettorato in modo non invasivo17. Il nebulizzatore è uno di questi dispositivi e ha dimostrato di produrre campioni di espettorato affidabili18,19,20. Sebbene il nebulizzatore sia un modo molto efficace per raccogliere in modo non invasivo l'espettorato, il suo utilizzo richiede comunque un ambiente in una struttura medica con personale specializzato21. Al contrario, dispositivi portatili come il flauto polmonare22,23,24 e l'acapella16,25 possono essere utilizzati a casa poiché sono molto user-friendly. Questi dispositivi di assistenza sono sicuri ed economici.
Per noi, l'acapella ha dato risultati costantemente migliori rispetto al flauto polmonare16 e, pertanto, il dispositivo a cappella è stato scelto per le collezioni di espettorato. È stato deciso un campione di raccolta di 3 giorni perché lo scopo principale per l'utilizzo dell'espettorato è quello di sviluppare un test di rilevamento del cancro del polmone16. È stato dimostrato che un campione di 3 giorni aumenta la probabilità di rilevamento del cancro del polmone rispetto a un campione di 1 o 2 giorni26,27,28. Tuttavia, altri metodi di raccolta dell'espettorato possono essere preferibili per scopi diversi. Se si utilizza un metodo di raccolta dell'espettorato diverso da quello qui descritto, si raccomanda di titolare attentamente ogni anticorpo o colorante utilizzato per l'analisi citometrica a flusso; sono disponibili pochissimi dati su come i diversi metodi di raccolta dell'espettorato influenzano le proteine mirate per la citometria a flusso.
Il secondo problema che smorza l'entusiasmo per l'uso dell'espettorato per la diagnostica, principalmente legato alla citometria a flusso, è il numero di cellule. Il problema è la raccolta di cellule vitali sufficienti per un'analisi affidabile. Due studi hanno dimostrato che i campioni di espettorato raccolti con metodi non invasivi, con l'aiuto di un dispositivo di assistenza, contengono abbastanza cellule vitali che possono essere utilizzate nella diagnosi clinica o negli studi di ricerca16,24. Tuttavia, nessuno di questi studi ha affrontato il problema del numero di cellule per quanto riguarda la citometria a flusso.
Per gli studi che costituiscono la base di questo protocollo, sono stati raccolti campioni di espettorato da partecipanti ad alto rischio di sviluppare il cancro del polmone seguendo le linee guida istituzionali approvate per ciascun sito di studio. I partecipanti ad alto rischio sono stati definiti come tra 55-75 anni, avendo fumato 30 anni e non avendo smesso di fumare negli ultimi 15 anni. Ai pazienti è stato mostrato come utilizzare il dispositivo a cappella secondo le istruzioni del produttore29 e hanno raccolto l'espettorato per tre giorni consecutivi a casa. Il campione è stato conservato in frigorifero fino all'ultima raccolta. L'ultimo giorno di raccolta, il campione è stato spedito al laboratorio durante la notte con un pacco freddo congelato. I campioni sono stati elaborati in una sospensione a cella singola il giorno in cui sono stati ricevuti. Con questo metodo di raccolta dell'espettorato, si ottengono più che sufficienti cellule vitali per un'analisi citometrica a flusso affidabile.
Infine, e in relazione al precedente problema del numero di cellule, è la questione di come rilasciare le cellule dell'espettorato dal suo ambiente mucinoso. Come si possono mantenere vitali le cellule e creare una sospensione monocellulare che non ostruisca il citometro a flusso? Basato sul lavoro iniziale di Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, questo protocollo descrive un metodo semplice e affidabile per l'elaborazione dell'espettorato in una sospensione a singola cellula adatta per l'analisi citometrica a flusso. Questo metodo ha utilizzato linee guida consolidate nella citometria a flusso32,33,34 per sviluppare un'efficiente strategia di etichettatura degli anticorpi per identificare le cellule ematopoietiche ed epiteliali nell'espettorato e fornire impostazioni dello strumento, misure di controllo della qualità e linee guida di analisi che standardizzano l'analisi dell'espettorato su una piattaforma citometrica a flusso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

L'espettorato, ampiamente utilizzato per studiare il contenuto cellulare e altre caratteristiche microambientali per comprendere la salute del polmone, viene tradizionalmente analizzato utilizzando metodologie basate sulla citologia. La sua utilità è limitata perché la lettura delle diapositive richiede molto tempo e richiede personale altamente specializzato. Inoltre, detriti estesi e la presenza di troppe cellule epiteliali squamose (VEC), o cellule della guancia, spesso rendono un campione inadeguato per la diagnosi. Al contrario, la citometria a flusso consente la fenotipizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari escludendo contemporaneamente detriti e SEC.
Il protocollo qui presentato descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula, colorare anticorpi e fissare popolazioni cellulari e acquisire campioni su una piattaforma citometrica a flusso. Una strategia di gating che descrive l'esclusione di detriti, cellule morte (compresi i SEC) e doppietti cellulari è presentata qui. Inoltre, questo lavoro spiega anche come analizzare le cellule vitali e singole dell'espettorato basate su un gruppo di differenziazione (CD)45 popolazioni positive e negative per caratterizzare i sottoinsiemi di lignaggio ematopoietico ed epiteliale. Una misura di controllo della qualità viene fornita anche identificando macrofagi polmonari specifici come prova che un campione è derivato dal polmone e non è saliva. Infine, è stato dimostrato che questo metodo può essere applicato a diverse piattaforme citometriche fornendo profili espettorati dello stesso paziente analizzati su tre citometri a flusso; Navios EX, LSR II e Lyric. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per includere ulteriori marcatori cellulari di interesse. Qui viene presentato un metodo per analizzare un intero campione di espettorato su una piattaforma citometrica a flusso che rende l'espettorato suscettibile di sviluppare diagnostica ad alto rendimento della malattia polmonare.

Questo protocollo è stato sviluppato pensando a un ambiente di laboratorio clinico. Durante lo sviluppo del protocollo ci si è concentrati sulla semplicità, l'efficienza e la riproducibilità. Si è scoperto che la fase più dispendiosa in termini di tempo nell'elaborazione dell'espettorato era il conteggio delle cellule. Pertanto, il protocollo è impostato in modo tale che l'elaborazione dell'espettorato e l'etichettatura delle cellule possano essere eseguite indipendentemente dal conteggio delle cellule senza perdi...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.

Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Questo protocollo risolve le sfide comuni riscontrate con l'elaborazione dell'espettorato che hanno reso difficile in passato l'uso con la citometria a flusso per scopi diagnostici clinici ad alto rendimento. Questo protocollo è progettato per risparmiare tempo utilizzando il peso dell'espettorato per determinare i volumi di colorazione di anticorpi e coloranti. Durante l'incubazione della colorazione, il conteggio delle cellule può essere eseguito per le fasi a valle.È importante ottenere un conteggio cellulare accurato per determinare il corretto volume di risospensione per prevenire eventuali problemi durante l'esecuzione sul citometro a flusso. Questo protocollo può fornire informazioni sulle aree di ricerca che studiano la salute dei polmoni. Ad esempio, potrebbero essere studiate malattie come la BPCO, l'asma, il cancro ai polmoni o gli effetti del COVID.A dimostrare la procedura sarà il Dr.Michael Lai, uno scienziato di ricerca e sviluppo del mio laboratorio. Per cominciare, pesare il campione di espettorato per determinare i volumi di reagenti di dissociazione. Trasferire il campione al recipiente di dimensioni appropriate in base al peso dell'espettorato, quindi aggiungere un millilitro per grammo dello 0,5% NAC e quattro millilitri per grammo dello 0,1% DTT.Vortice i campioni alla massima velocità per 15 secondi e oscilla alla massima velocità per 15 minuti a temperatura ambiente. Diluire questo campione con soluzione salina bilanciata 4X Hanks o HBSS per neutralizzare il NAC e il DTT. E dopo un rapido vortice, scuotere il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 100 micrometri in uno o più tubi centrifughici conici da 50 millilitri per creare una sospensione a cella singola. Pellet giù per le celle. Dopo aver aspirato il surnatante, combinare i pellet in un tubo conico da 15 millilitri e lavare con HBSS nelle stesse condizioni.Risospesso il pellet cellulare in un volume di tampone determinato dal peso iniziale del campione di espettorato. Prendere un'aliquota dalla sospensione cellulare e mescolare 10 microlitri della diluizione dell'espettorato con 30 microlitri di blu tripano allo 0,4%, quindi caricare nelle camere di conteggio di un emocitometro per un conteggio delle cellule vive / morte. Etichettare l'espettorato nei tubi di compensazione.Aggiungere l'anticorpo HBSS e il colorante a ciascun tubo cellulare dell'espettorato e ai tubi di compensazione come indicato nel testo. Aggiungere le cellule dell'espettorato ai tubi di analisi e aggiungere perline di compensazione ai tubi di compensazione come menzionato nel testo. Incubare tutti i tubi sul ghiaccio protetti dalla luce per 35 minuti.Quindi, dopo aver riempito i tubi con HBSS ghiacciato, centrifugare a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 800 volte G.Per i tubi di compensazione, aspirare il surnatante il più vicino possibile al pellet e far scorrere il pellet per allentare. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di HBSS freddo ai tubi di compensazione e conservare i tubi sul ghiaccio in un'area protetta dalla luce fino a quando non è necessario per l'analisi della citometria a flusso. Quindi aspirare il surnatante dall'espettorato non macchiato, dall'isotipo, dal sangue e dai tubi epiteliali.Allentare i pellet facendo scorrere i tubi. Aggiungere due millilitri di 1% PFA ai tubi non macchiati e isotipici e 10 millilitri ai tubi del sangue e dell'epitelio. Incubare i tubi sul ghiaccio in modo protetto dalla luce per 30 minuti, quindi ruotare rapidamente alla massima velocità e incubare di nuovo per altri 30 minuti.Quindi riempire i tubi con HBSS ghiacciato. Successivamente, centrifugare i tubi a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.600 volte G.Aspirare il più possibile surnatante senza disturbare il pellet cellulare e far scorrere il tubo con le dita per allentare le cellule, quindi aggiungere 200 microlitri di HBSS freddo ai tubi non macchiati e isotipi. Calcolare e aggiungere il volume richiesto di HBSS per la risospensione del sangue e del tubo epiteliale in base al numero totale di cellule.Conservare tutti i campioni in provette di compensazione protette dalla luce sul ghiaccio a quattro gradi Celsius fino all'esecuzione dell'analisi citometrica a flusso. Applicare procedure di avvio appropriate per il citometro a flusso utilizzato. Utilizzare la miscela di perline del National Institute of Standards and Technology o del NIST per garantire che le tensioni di dispersione diretta e di dispersione laterale siano impostate per posizionare le perle NIST per coprire la trama senza posizionare le perline troppo vicino agli assi.Impostare la portata su media per LSRII o alta per Navios EX. Regolare le tensioni per ciascun parametro utilizzato per i parametri scatter e fluorescenti per posizionare le popolazioni cellulari su scala. Usa le figure con la strategia di gating come guida per regolare le tensioni di conseguenza. Acquisire prima i dati per il campione di espettorato non macchiato, seguito dal campione colorato con isotipo, quindi dalla sonda sanguigna e dalla tuba epiteliale.Il peso dell'espettorato è stato utilizzato per determinare i volumi di anticorpi o coloranti per la colorazione. La correlazione tra peso dell'espettorato e resa cellulare non era forte. I campioni di espettorato sono stati divisi in quattro categorie di peso, che si sono raggruppate nella distribuzione della resa cellulare.Ogni anticorpo utilizzato è stato titolato in una concentrazione nella fase di plateau con il più alto indice di colorazione è stato scelto come concentrazione di lavoro. In tutte le categorie di peso, la contaminazione media da SEC era inferiore al 20% con la percentuale di cellule vitali mostrate. Viene presentata la strategia di gating utilizzata per l'analisi.Le perle del NIST sono state utilizzate per impostare un cancello che è stato applicato al campione di espettorato per eliminare i detriti. Piccoli detriti sono stati ulteriormente eliminati dal cancello largo. Il colorante di vitalità è stato utilizzato per eliminare le cellule morte, mentre il cancello del singoletto ha rimosso i doppietti.L'etichettatura degli anticorpi anti-CD45 ha permesso la separazione di singole cellule espettorato vive in una cellula del sangue e in un compartimento non di cellule del sangue. I profili ottenuti da Navios EX, LSRII e Lyric sono stati confrontati. Viene mostrata la strategia di gating per eliminare i detriti, le cellule morte, i doppietti e confrontare i profili di sangue e non sangue.Questa tecnica ci ha permesso di applicare questi metodi per rilevare il rischio di cancro al polmone da utilizzare come test clinico non invasivo.

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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Medicina

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereologica e Citometria a Flusso Caratterizzazione dei leucociti sottopopolazioni in modelli di transitori o permanenti Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) In citometria a flusso

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Caratterizzazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo umano mediante citometria a flusso

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.