Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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ダビド・ロドリゲスのフィギュア準備に対する彼の支援に感謝したいと思います。痰サンプルは、UTヘルス、NIH-NCI P30 CA054174-20(UTヘルスのCTRC)およびUL1 TR001120(CTSA助成金)によってサポートされているUTヘルスサンアントニオフローサイトメトリー共有リソース施設のBD LSR IIで実行されました。

痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。
1. 痰解離開始前の試薬製剤
<ol><li>1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。 注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°C?...

痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片37を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔38の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。...

フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に1,2,3,4個同定することが可能になりました。例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系2および造血系5の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別を6,7,8に導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)12,13,14,15などの疾患の診断および/またはモニタリングに大きな助けとなる可能性があることを示唆している。さらに、フローサイトメトリーに使用できる上皮特異的マーカーの存在は、痰、肺上皮細胞における細胞の次の最も重要なサブセットの尋問を可能にする。
異なる組織起源の多くの異なる細胞集団を分析する能力に加えて、フローサイトメーターは比較的短い期間で多数の細胞を評価することができる。それに比べて、スライドベースの細胞学的なタイプの分析には、多くの場合、高度に専門性の高い人員や機器が必要です。これらの分析は、作業集約的であり、分析される痰サンプルの割合に過ぎない。
3つの重大な問題は、フローサイトメトリーにおける痰の広範な使用を制限する。最初の問題は、痰のコレクションに関連しています。痰は、肺から口腔に粘液を排出するハフ咳を通して収集され、その後、コレクションカップに唾を吐く。粘液は口腔内を通過するので、SEC汚染の可能性が高い。この汚染は検体分析を複雑にしますが、この研究で示されるように、フローサイトメトリックプラットフォーム上で問題が容易に修正されます。
誰もが自発的に痰を作り出すことができるわけではありません。したがって、いくつかの装置は、非侵襲的な方法で痰の収集を支援するために開発された17。ネブライザーは、そのような装置の1つであり、信頼性の高い痰サンプル18,19,20を生成することが示されている。ネブライザーは、非侵襲的に痰を収集する非常に効果的な方法であるが、その使用はまだ専門の人員21を有する医療施設での設定を必要とする。対照的に、肺フルート22,23,24やacapella16,25などのハンドヘルドデバイスは、非常にユーザーフレンドリーであるため、自宅で使用することができます。これらの補助装置は安全で費用効果が高い。
私たちにとって、アカペラは肺flute16よりも一貫して良い結果を与えたので、アカペラ装置は痰のコレクションのために選ばれました。痰を使用する主な目的は、肺癌検出テスト16を開発することであるため、3日間の採取サンプルが決定されました。3日間のサンプルは、1日または2日間のサンプル26,27,28と比較して肺癌検出の可能性を高めることが示されている。しかしながら、痰の収集の他の方法は、異なる目的のために好ましいかもしれない。ここで説明した痰の収集方法とは異なる場合は、フローサイトメトリクス分析に使用される各抗体または色素を注意深く評価することをお勧めします。異なる喀痰の収集方法がフローサイトメトリーの標的タンパク質にどのような影響を与えるかについては、ごくわずかなデータが利用できます。
第二の問題は、主にフローサイトメトリーに関連する診断に痰を使用するための熱意を減衰させる、細胞数である。問題は、信頼性の高い分析に十分な生存細胞の収集です。2つの研究は、非侵襲的な方法によって収集された痰サンプルが、補助装置の助けを借りて、臨床診断または研究研究で利用できる十分な生存細胞を含み、16,24を示した。しかし、これらの研究はいずれもフローサイトメトリーに関する細胞数の問題に取り組まないようにした。
このプロトコルの基礎となる研究では、各研究部位に対して承認された制度ガイドラインに従って、肺癌を発症する危険性が高い参加者から喀痰サンプルを採取した。リスクの高い参加者は55年から75年の間と定義され、30パック年を吸い、過去15年以内に禁煙しなかった。患者は、メーカーの指示に従ってアカペラ装置を使用する方法を示された29 、自宅で3日間連続して痰を採取した。サンプルは最後のコレクションまで冷蔵庫に保管していました。最終採取日に、サンプルは冷凍コールドパックで一晩実験室に出荷されました。サンプルは、受け取った日に単一の細胞懸濁液に処理された。この喀痰収集法により、信頼性の高いフローサイトメトリック解析のために十分以上の生存細胞が得られます。
最後に、以前の細胞数問題に関連して、痰細胞をそのマス状環境からどのように放出させるかという問題である。細胞を生存可能に保ち、フローサイトメーターを詰まらせない単一細胞懸濁液を作り出す方法は?Pizzichini et al.30およびMillerら31の初期の研究に基づいて、このプロトコルは、フローサイトメトリック分析に適した単一の細胞懸濁液への痰処理のための容易で信頼性の高い方法を記述する。この方法は、フローサイトメトリ32,33,34の定評のあるガイドラインを用いて、喀痰中の造血細胞および上皮細胞を同定し、計器設定、品質管理措置、および流体細胞測定プラットフォーム上で痰分析を標準化する分析ガイドラインを提供するための効率的な抗体標識戦略を開発しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。
ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。

このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられ?...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。

フローサイトメトリーによる品質管理痰解析

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

このプロトコルは、従来、高スループットの臨床診断目的でフローサイトメトリーで使用することが困難になった喀痰処理で経験した一般的な課題を解決します。このプロトコルは、痰の重量を使用して抗体と染色染色量を決定することで時間を節約するように設計されています。染色インキュベーションの間、下流工程に対して細胞数を行うことができる。フローサイトメーターでの動作時に問題が発生するのを防ぐために、正確なセルカウントを達成して正しい再懸濁液量を決定することが重要です。このプロトコルは、肺の健康を調査する研究分野に関する洞察を提供することができます。例えば、COPD、喘息、肺癌、またはCOVIDの影響などの病気を研究することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究開発科学者であるマイケル・ライ博士です。まず、痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。痰の重量に基づいて適切なサイズの容器にサンプルを移し、0.5%NACのグラム当たり1ミリリットル、0.1%DTTのグラム当たり4ミリリットルを加えます。最高速度で15秒間、最高速度でサンプルを渦を出し、室温で15分間最高速度で揺れ動きます。このサンプルを4Xハンクスバランス塩溶液またはHBSSで希釈して、NACとDTTを中和します。そして、迅速な渦の後、室温でサンプルを5分間揺らします。フィルターセルサスペンションは、100マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50ミリリットルの円錐型遠心分離チューブに入り、単一細胞懸濁液を作成します。細胞をペレットダウンします。上清を吸引した後、15ミリリットル円錐形チューブにペレットを組み合わせ、同じ条件でHBSSで洗浄します。細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。細胞懸濁液からアリコートを取り、0.4%トリパンブルーの30マイクロリットルで痰希釈の10マイクロリットルを混合し、生きている/死んだ細胞数のためにヘモサイトメーターの計数室にロードする。補償管のラベルの痰。テキストに示されているように、HBSS抗体と色素を各喀痰細胞チューブおよび補償チューブに追加します。痰細胞をアッセイチューブに加え、テキストに記載されているように補償チューブに補償ビーズを追加します。氷上のすべてのチューブを35分間、光から保護してインキュベートします。その後、氷冷HBSSでチューブを充填した後、800倍のG.補償チューブで10分間摂氏4度で遠心分離機、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。次に、0.5ミリリットルの冷たいHBSSを補償管に加え、フローサイトメトリー分析に必要になるまで氷上のチューブを光保護領域に保管します。次いで、上清を、染色されていない痰、アイソタイプ、血液、および上皮管から吸引する。チューブをフリックしてペレットを緩めます。1%PFAの2ミリリットルを未染色およびアイソタイプチューブに加え、血液および上皮管に10ミリリットルを加えます。氷上のチューブを光保護された方法で30分間インキュベートし、最高速度で素早く渦を出し、さらに30分間再びインキュベートします。その後、氷冷HBSSでチューブを充填します。次に、細胞ペレットを乱さずに10分間、600倍のG.吸入体で摂氏4度でチューブを遠心分離し、指でチューブをフリックして細胞を緩め、200マイクロリットルの冷たいHBSSを未染色およびアイソタイプチューブに加えます。総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためにHBSSの必要な容積を計算し、加える。フローサイトメトリー解析が行われるまで、氷上の光から保護された補償管に全てのサンプルを摂氏4度で保存します。使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。国立標準技術研究所またはNISTビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロットにスパンするようにNISTビーズを配置します。LSRII の場合は流量を中に設定し、Navios EX の場合は高に設定します。散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整するためのガイダンスとして、ゲージ戦略を持つ数字を使用してください。最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。痰重量を用いて、染色用の抗体または色素量を決定した。痰の重さと細胞収量の相関は強くはなかった。痰サンプルは、細胞収量の分布に集まった4つの重量カテゴリに分けられた。使用した各抗体は、最も高い染色指数を有する高原相上濃度で滴定し、働き濃度として選択した。すべての重量カテゴリーにおいて、平均SEC汚染は20%未満であり、生存細胞の割合が示された。提示は、分析に使用される格言戦略です。NISTビーズは、破片を除去するために痰サンプルに適用されたゲートを設定するために使用されました。小さな破片は、幅のゲートによってさらに排除されました。生存性染料は死んだ細胞を排除するために使用され、シングルゲートはダブレットを除去した。抗CD45抗体標識により、生きた単一喀痰細胞を血液細胞および非血液細胞区画に分離することができた。ナビオスEX、LSRII、およびリリックから得られたプロファイルを比較した。破片、死んだ細胞、ダブレットを排除し、血液と非血液プロファイルを比較するための格言戦略が示されている。この技術は、これらの方法を適用して、非侵襲的な臨床検査として使用するための肺癌リスクを検出することを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Medicine

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...