Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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데이비드 로드리게스가 피겨 준비를 해준 것에 대해 감사드립니다. 가래 샘플은 UT 헬스 샌안토니오 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 BD LSR II에서 실행되었으며, UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (UT Health의 CTRC) 및 UL1 TR001120 (CTSA 보조금)에 의해 지원되었습니다.

가래 처리의 모든 단계는 적절한 개인 보호 장비와 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. 가래 해리를 시작하기 전에 시약 준비
<ol><li>1% 파라포름알데히드(PFA), 얼음 샘플당 25mL를 해동하고, 사용할 때까지 차갑게 유지하십시오. 주의: PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 유독합니다. 제조업체의 지시에 따라 고정을 준비하고 사용할 때까지 25 mL 알리코에서 -20 °C에서 동결?...

가래의 세포 함량은 광범위한 세포의 큰 다양성을 포함, 종종 파편을 많이 동반37. 또한, 가래 분석은 구강 대신 폐로부터 채취되는 시료를 확인하는 품질 관리를 필요로한다38. 따라서, 혈액, 예를 들어 훨씬 더 깨끗하고 균일한 세포 현탁액을 방출하는 혈액에 대한 것처럼 혈류 세포측정에 의해 가래를 분석하는 것은 간단하지 않다. 이 프로토콜은 이러한 모든 ...

흐름 세포계의 하드웨어 및 소프트웨어의 기술적 발전으로 인해 많은 별개의 세포 집단을 동시에 식별할 수 있게 되었습니다1,2,3,4. 조혈 세포 연구에서 유동 세포계의 활용은 예를 들어, 면역 체계2및 조혈계의 세포 계층 구조에 대한 훨씬 더 나은 이해를 주도하고 있으며, 다양한 혈액암의 진단 구별을 이끌어 냈다6,7,8. 대부분의 가래 세포는 조혈 기원9,10,11이지만, 유동 세포분석은 진단 목적을 위해 가래 분석에 널리 적용되지 않았습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 가래에 있는 면역 세포 인구의 평가 (세포의 가장 중요한 부분 집합)가 천식과 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)12,13,14,15와 같은 질병을 진단 및/또는 모니터링하는 데 큰 도움이 될 수 있음을 시사한다. 더욱이, 유동 세포측정에 사용될 수 있는 상피 특이적 마커의 존재는 가래, 폐 상피 세포에서 세포의 다음 가장 중요한 부분 집합의 심문을 허용한다.
다른 조직 기원의 많은 뚜렷한 세포 집단을 분석하는 기능 이외에, 유동 세포계는 상대적으로 짧은 기간에 많은 수의 세포를 평가할 수 있다. 이에 비해 슬라이드 기반 의 세포학적 유형의 분석에는 고도로 전문화된 인력 및/또는 장비가 필요한 경우가 많습니다. 이러한 분석은 노동 집약적 일 수 있으며, 이는 분석되는 가래 샘플의 비율만으로 이어집니다16.
세 가지 중요한 문제는 유동 세포 측정에 가래의 광범위한 사용을 제한합니다. 첫 번째 문제는 가래 의 컬렉션에 관한 것입니다. 가래는 폐에서 구강으로 점액을 추방하는 허프 기침을 통해 수집되어 수집 컵에 침을 뱉습니다. 점액은 구강을 통과하기 때문에 SEC 오염의 가능성이 높습니다. 이 오염은 표본 분석을 복잡하게 하지만 이 연구에서와 같이 유동 사이토메트릭 플랫폼에서 문제가 쉽게 수정됩니다.
모든 사람이 자발적으로 가래를 생산할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서, 비침습적 방식으로 가래 수집을 지원하기 위해 여러 장치가 개발되었다17. 분무기는 이러한 장치 중 하나이며 신뢰할 수있는 가래 샘플18,19,20을 생성하는 것으로 나타났습니다. 분무기는 비침습적으로 가래를 수집하는 매우 효과적인 방법이지만, 그 사용은 여전히 전문 인력이있는 의료 시설에서 설정이 필요합니다21. 대조적으로, 폐 플루트22,23,24 및 아카펠라16,25와 같은 핸드헬드 장치는 매우 사용자 친화적이기 때문에 집에서 사용할 수 있다. 이러한 보조 장치는 안전하고 비용 효율적입니다.
우리를 위해, 아카펠라는 폐 플루트16 보다는 일관되게 더 나은 결과를 주었고, 그러므로, 아카펠라 장치는 가래 수집을 위해 선택되었습니다. 가래를 사용하기 위한 주된 목적은 폐암 검출 시험16을 개발하는 것이기 때문에 3일 수집 샘플이 결정되었다. 3일 샘플은 1일 또는 2일 샘플26,27,28에 비해 폐암 검출 가능성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 다른 가래 수집 방법은 다른 목적을 위해 바람직할 수 있다. 상이한 가래 수집 방법이 여기에 기재된 것과 다른 가래 수집 방법이 사용되는 경우, 유동 세포 측정 분석에 사용되는 각 항체 또는 염료를 신중하게 적정하게 적정화하는 것이 좋습니다. 아주 작은 데이터는 다른 가래 수집 방법이 유동 세포측정을 위한 표적으로 한 단백질에 어떻게 영향을 미치는지에 유효합니다.
주로 유동 세포측정과 관련된 진단을 위한 가래사용에 대한 열정을 약화시키는 두 번째 문제점은 세포수이다. 문제는 신뢰할 수 있는 분석을 위한 충분한 실행 가능한 셀의 집합입니다. 두 가지 연구는 보조 장치의 도움으로 비 침습적 인 방법에 의해 수집 된 가래 샘플이 임상 진단 또는 연구 연구에서 활용할 수있는 충분한 실행 가능한 세포를 포함하고 있음을 입증16,24. 그러나, 이러한 연구의 어느 쪽도 흐름 세포 측정에 관한 세포 수의 문제를 해결.
이 프로토콜에 대한 기초를 형성하는 연구를 위해, 가래 견본은 각 연구 사이트에 대한 승인된 기관 지침에 따라 폐암 개발을 위한 고위험에 참가자에게서 집합되었습니다. 고위험 참가자는 55-75 년 사이 정의 되었습니다., 훈제 30 팩 년 지난 15 년 이내에 흡연을 종료 하지 않은. 환자는 제조 업체의 지침에 따라 아카펠라 장치를 사용하는 방법을 보여주었다29 집에서 3 일 연속 가래를 수집. 샘플은 마지막 컬렉션까지 냉장고에 보관되었습니다. 마지막 수집 일에, 샘플은 냉동 차가운 팩과 함께 하룻밤 실험실로 배송되었다. 샘플은 수신된 날에 단일 세포 현탁액으로 처리되었습니다. 가래 수집의 이 방법을 사용하여, 믿을 수 있는 유동 세포 측정 분석을 위해 충분한 실행 가능한 세포이상을 얻습니다.
마지막으로, 이전 세포 번호 문제와 관련, 그 뮤추얼 환경에서 가래 세포를 방출하는 방법의 문제입니다. 세포는 어떻게 실행 가능한 유지하고 흐름 세포계를 막히지 않는 단일 세포 현탁액을 만들 수 있습니까? Pizzichini et al.30 및 Miller 외.31의 초기 작업을 기반으로, 이 프로토콜은 유동 세포 측정 분석에 적합한 단일 세포 현탁액으로 가래 처리를 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 유동 세포측정32,33,34에 잘 확립된 가이드라인을 사용하여 가래에 있는 조혈 및 상피 세포를 식별하고 계측기 설정, 품질 관리 조치 및 유동 세포 측정 플랫폼에서 가래 분석을 표준화하는 분석 지침을 제공하기 위한 효율적인 항체 라벨링 전략을 개발했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

가래는 세포 함량 및 폐의 건강을 이해하기 위해 다른 미세 환경 적 특징을 연구하는 데 널리 사용되며, 전통적으로 세포학 기반 방법론을 사용하여 분석됩니다. 슬라이드를 읽는 데 시간이 많이 걸리며 고도로 전문화된 인력이 필요하기 때문에 유틸리티가 제한됩니다. 더욱이, 광범위한 파편과 너무 많은 편평상피 세포 (SEC) 또는 뺨 세포의 존재는 종종 진단을 위해 부적당한 견본을 렌더링합니다. 대조적으로, 유동 세포측정은 동시에 파편과 SEC를 제외하면서 세포 집단의 높은 처리량 phenotyping을 허용합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 현탁액, 항체 얼룩 및 세포 집단을 고치고, 유동 세포 측정 플랫폼에서 샘플을 획득하는 효율적인 방법을 설명합니다. 파편, 죽은 세포 (SE포함) 및 세포 이중제의 배제를 설명하는 게이팅 전략이 여기에 제시됩니다. 또한, 이 작품은 또한 조혈 및 상피 계보 하위 집합을 특성화하기 위해 분화(CD)45 양성 및 음수 집단의 클러스터를 기반으로 실행 가능한 단일 가래 세포를 분석하는 방법을 설명한다. 품질 관리 측정은 또한 견본이 폐에서 파생되고 타액이 아니라는 것을 기록으로 폐 특정 대식세포를 확인해서 제공됩니다. 마지막으로, 이 방법은 3개의 유동 세포계에서 분석된 동일한 환자에게서 가래 프로파일을 제공함으로써 상이한 세포측정 플랫폼에 적용될 수 있다는 것이 입증되었다; 나비오스 EX, LSR II 및 가사. 더욱이, 이 프로토콜은 관심의 추가 세포 마커를 포함하도록 수정될 수 있다. 유동 세포측정 플랫폼에서 전체 가래 샘플을 분석하는 방법이 여기에 제시되어 폐 질환의 고처리량 진단을 개발하기 위해 가래가 가능하도록 합니다.

이 프로토콜은 임상 실험실 설정을 염두에 두고 개발되었습니다. 프로토콜을 개발하는 동안 초점은 단순성, 효율성 및 재현성에 있었습니다. 가래 처리에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계가 세포를 세는 것으로 나타났습니다. 따라서, 프로토콜은 가래 처리 및 세포 라벨링이 시간 손실 없이 세포 계산과 독립적으로 수행될 수 있는 방식으로 설정된다. 가려지지 않은 실행을 위해 시료를 적절히 ...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

이 프로토콜은 가래를 단일 셀 서스펜션으로 분리하고 표준 흐름 세포 측정 플랫폼에서 셀룰러 하위 집합의 후속 특성화를 결합하는 효율적인 방법을 설명합니다.

유동 세포측정에 의한 품질 제어 가래 분석

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

이 프로토콜은 고처리량 임상 진단 목적을 위해 과거에 유동 세포측정과 함께 사용하기 어렵게 만든 가래 처리로 경험된 일반적인 과제를 해결합니다. 이 프로토콜은 가래 중량을 사용하여 항체 및 염색 부피를 결정함으로써 시간을 절약하도록 설계되었습니다. 염색 인큐베이션 동안 다운스트림 단계에 대해 셀 수를 수행할 수 있습니다.정확한 셀 카운트를 달성하여 정확한 재서스펜션 부피를 결정하여 유동 세포계에서 실행할 때 문제를 방지하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 폐 건강을 조사하는 연구 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 예를 들면, COPD, 천식, 폐암, 또는 COVID의 효력과 같은 질병은 공부될 수 있었습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 개발 과학자 인 마이클 라이 박사가 될 것입니다. 시작하려면 가래 시료를 계량하여 해리 시약의 양을 결정합니다. 가래 중량을 기준으로 적절한 크기의 용기에 샘플을 옮은 다음 0.5%NAC의 그램당 1밀리리터와 0.1%DTT의 그램당 4밀리리터를 추가합니다.샘플을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이치며 실온에서 15분 동안 최대 속도로 바위를 휘감습니다. 이 샘플을 4X 행크스 균형 잡힌 염용액 또는 HBSS로 희석하여 NAC 및 DTT를 중화시합니다. 그리고 빠른 소용돌이 후, 5 분 동안 실온에서 샘플을 바위.100 마이크로미터 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 하나 이상의 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 세포를 아래로 펠릿. 상체를 심은 후, 15 밀리리터 원뿔 관에 펠릿을 결합하고 동일한 조건에서 HBSS로 세척하십시오.가래 샘플의 초기 중량에 의해 결정된 버퍼의 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액에서 알리쿼시를 가져 와서 가래 희석의 10 마이크로 리터를 0.4 % 트라이팬 블루의 30 마이크로 리터와 혼합 한 다음 살아있는 / 죽은 세포 수를 위해 혈류계의 카운팅 챔버에 적재하십시오. 보상 튜브의 라벨 가래.텍스트에 표시된 바와 같이 각 가래 세포 관 및 보상 튜브에 HBSS 항체 및 염료를 추가합니다. 가래 세포를 분석 튜브에 추가하고 텍스트에 언급 된 바와 같이 보상 구슬을 보상 튜브에 추가합니다. 35분 동안 빛으로부터 보호되는 얼음에 있는 모든 튜브를 배양합니다.그런 다음 얼음 차가운 HBSS로 튜브를 채운 후, 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 800회 G.For 보정 튜브를 위해, 펠릿에 가깝게 슈퍼네티얼을 흡인하고 펠릿을 플러플하여 풀기 위해 움직입니다. 다음으로, 0.5 밀리리터의 차가운 HBSS를 보상 튜브에 추가하고 유동 세포 측정 분석에 필요할 때까지 얼음에 튜브를 저장합니다. 그런 다음 가래, 동종형, 혈액 및 상피 튜브에서 상류체를 흡인시합니다.튜브를 가볍게 하여 펠릿을 풀어줍니다. 얼룩이 없는 및 동종형 튜브에 1%PFA의 밀리리터 2개와 혈액 및 상피 튜브에 10 밀리리터를 추가합니다. 30분 동안 얼음에 튜브를 배양한 다음, 최대 속도로 빠르게 소용돌이를 타고 다시 30분 동안 배양합니다.그런 다음 얼음 차가운 HBSS로 튜브를 채웁니다. 다음으로, 1, 600배 G.Aspirate에서 10분 동안 4도에서 튜브를 원심분리하고 손가락으로 튜브를 쓸어서 세포를 풀어주면, 얼룩이 없는 및 동형 튜브에 200 마이크로리터를 추가합니다. 총 세포 수에 따라 혈액 및 상피 관의 재발을 위해 HBSS의 필요한 부피를 계산하고 추가합니다.유동 세포 측정 분석이 수행될 때까지 얼음의 빛으로부터 보호되는 보상 튜브에 모든 샘플을 저장합니다. 사용되는 흐름 사이토미터에 적합한 시작 절차를 적용합니다. 국립 표준 기술 연구소 또는 NIST 구슬의 혼합물을 사용하여 구슬을 축에 너무 가깝게 두지 않고 NIST 구슬을 배치하도록 전방 분산 및 측면 산란 전압이 설정되어 있는지 확인합니다.Navios EX의 경우 LSRII 또는 높음의 유량을 중간크기로 설정합니다. 분산 및 형광 파라미터에 사용되는 각 매개 변수에 대한 전압을 조정하여 세포 모집단을 스케일로 배치합니다. 게이팅 전략과 함께 수치를 사용하여 전압을 조정하는 지침으로 사용합니다. 먼저 얼룩이 없는 가래 샘플에 대한 데이터를 획득한 다음 동형 염색 샘플, 그리고 혈액 관 및 상피 튜브를 채취한다음 한다.가래 중량은 염색을 위한 항체 또는 염료 부피를 결정하기 위하여 이용되었습니다. 가래 중량과 세포 수율 사이의 상관 관계는 강하지 않았습니다. 가래 샘플은 세포 수율분포에 클러스터된 4개의 중량 범주로 나뉘었다.사용된 각 항체는 가장 높은 염색 지수를 가진 고원 상상에 대한 농도에서 적정화되어 작업 농도로 선택되었다. 모든 중량 범주에서, 평균 SEC 오염은 실행 가능한 세포의 백분율로 20% 미만이었습니다. 제시는 분석에 사용되는 게이팅 전략입니다.NIST 구슬은 이물질을 제거하기 위해 가래 샘플에 적용 된 게이트를 설정하는 데 사용되었다. 폭 게이트에 의해 작은 파편이 더 제거되었습니다. 생존 염료는 죽은 세포를 제거하는 데 사용되었으며, 단일 게이트는 이중을 제거했습니다.항 CD45 항체 라벨링은 살아있는 단일 가래 세포를 혈액 세포 및 비 혈액 세포 구획으로 분리할 수 있었습니다. Navios EX, LSRII 및 가사에서 얻은 프로파일을 비교했습니다. 파편, 죽은 세포, 이중 및 혈액 및 비 혈액 프로파일을 비교하기위한 게이팅 전략이 표시됩니다.이 기술은 우리가 비 침습적 임상 시험으로 사용하기 위한 폐암 리스크를 검출하기 위하여 이 방법을 적용하는 것을 허용했습니다.

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SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

연구

의학

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

선 유도 및 실험실 방법론

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.