Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vil takke David Rodriguez for hans hjelp med figurforberedelsene. Sputumprøver ble kjørt på BD LSR II ved UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, støttet av UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC ved UT Health) og UL1 TR001120 (CTSA grant).

Alle trinn i sputumbehandlingen utføres i et biologisk sikkerhetsskap med passende personlig verneutstyr.
1. Reagensforberedelse før du starter sputum dissosiasjon
<ol><li>Tine 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prøve på is, og hold deg kald til bruk. FORSIKTIG: PFA er giftig ved innånding og hudkontakt. Forbered fikseringsmiddelet i henhold til produsentens instruksjoner og frys ved -20 °C i 25 ml aliquots til bruk.</li>
	<li>Omtrent vekten av prøven og tine nok 0,1% Dithiothreit...

Det cellulære innholdet av sputum inkluderer et stort utvalg av brede celler, ofte ledsaget av mye rusk37. I tillegg krever sputumanalyse en kvalitetskontroll som bekrefter at prøven samles inn fra lungen i stedet for munnhulen38. Derfor er det ikke så enkelt å analysere sputum ved strømningscytometri som det er for blod, for eksempel, som frigjør en mye renere og homogen cellefjæring. Denne protokollen har adressert alle disse problemene: å gi instrumentinnstilling...

Tekniske fremskritt innen maskinvare og programvare for flytcytometere har gjort det mulig å identifisere mange forskjellige cellepopulasjoner samtidig1,2,3,4. Utnyttelsen av strømningscytometeret i hematopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en mye bedre forståelse av immunsystemet2 og det cellulære hierarkiet i det hematopoietiske systemet5, samt det diagnostiske skillet mellom en rekke forskjellige blodkreft6,7,8. Selv om de fleste sputumceller er av hematopoietisk opprinnelse9,10,11, har strømningscytometri ikke blitt mye brukt på sputumanalyse for diagnostiske formål. Flere studier tyder imidlertid på at evalueringen av immuncellepopulasjoner i sputum (den viktigste undergruppen av celler) kan være til stor hjelp ved diagnostisering og/eller overvåking av sykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)12,13,14,15. Videre tillater eksistensen av epitelspesifikke markører som kan brukes i strømningscytometri forhør av følgende mest signifikante undergruppe av celler i sputum, lungeepitelceller.
I tillegg til evnen til å analysere mange forskjellige cellepopulasjoner av forskjellig vevsopprinnelse, kan et strømningscytometer evaluere et stort antall celler på relativt kort tid. Til sammenligning krever lysbildebaserte, cytologiske typer analyser ofte høyt spesialisert personell og/eller utstyr. Disse analysene kan være arbeidskrevende, noe som fører til at bare en andel av sputumprøven analyseres16.
Tre kritiske spørsmål begrenser den utbredte bruken av sputum i strømningscytometri. Det første problemet gjelder innsamling av sputum. Sputum samles gjennom en huff hoste som utviser slim fra lungene inn i munnhulen, og spytter deretter inn i en oppsamlingskopp. Siden slimet beveger seg gjennom munnhulen, er det stor sjanse for SEC-forurensning. Denne forurensningen kompliserer prøveanalysen, men problemet rettes lett på en strømningscytometrisk plattform, som vist i denne studien.
Ikke alle kan produsere sputum spontant; Derfor er flere enheter utviklet for å hjelpe til med sputumsamlingen på en ikke-invasiv måte17. Forstøveren er en slik enhet og har vist seg å produsere pålitelige sputumprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en svært effektiv måte å ikke invasivt samle sputum på, krever bruken fortsatt en innstilling på et medisinsk anlegg med spesialisert personell21. I motsetning til dette kan håndholdte enheter som lungefløyten22,23,24 og acapella16,25 brukes hjemme siden de er veldig brukervennlige. Disse hjelpeenhetene er både trygge og kostnadseffektive.
For oss ga acapella konsekvent bedre resultater enn lungefløyten16, og derfor er acapella-enheten valgt for sputumsamlinger. En 3-dagers samlingsprøve ble bestemt fordi hovedformålet med bruk av sputum er å utvikle en lungekreftdeteksjonstest16. Det har vist seg at en 3-dagers prøve øker sannsynligheten for lungekreftdeteksjon sammenlignet med en 1- eller 2-dagers prøve26,27,28. Imidlertid kan andre metoder for sputumsamling være å foretrekke for forskjellige formål. Hvis en annen sputumoppsamlingsmetode brukes enn den som er beskrevet her, anbefales det å nøye titrate hvert antistoff eller fargestoff som brukes til strømningscytometrisk analyse; svært lite data er tilgjengelig om hvordan ulike sputuminnsamlingsmetoder påvirker de målrettede proteinene for strømningscytometri.
Det andre problemet som demper entusiasmen for å bruke sputum for diagnostikk, hovedsakelig relatert til strømningscytometri, er cellenummer. Problemet er innsamling av tilstrekkelige levedyktige celler for en pålitelig analyse. To studier viste at sputumprøver samlet inn ved ikke-invasive metoder, ved hjelp av en hjelpeenhet, inneholder nok levedyktige celler som kan brukes i klinisk diagnose eller forskningsstudier16,24. Imidlertid tok ingen av disse studiene opp spørsmålet om celletall angående strømningscytometri.
For studiene som danner grunnlaget for denne protokollen, ble det samlet inn sputumprøver fra deltakere med høy risiko for å utvikle lungekreft etter godkjente institusjonelle retningslinjer for hvert studiested. Høyrisikodeltakere ble definert som mellom 55-75 år, etter å ha røkt 30 pakkeår og ikke sluttet å røyke i løpet av de siste 15 årene. Pasienter ble vist hvordan man bruker acapella-enheten i henhold til produsentens instruksjoner29 og samlet sputum i tre påfølgende dager hjemme. Prøven ble oppbevart i kjøleskapet til siste oppsamling. På den siste innsamlingsdagen ble prøven sendt til laboratoriet over natten med en frossen kald pakke. Prøvene ble behandlet til en enkelt celle suspensjon den dagen de ble mottatt. Med denne metoden for sputumsamling oppnås mer enn nok levedyktige celler for en pålitelig strømningscytometrisk analyse.
Til slutt, og relatert til det forrige cellenummerproblemet, er spørsmålet om hvordan du frigjør sputumcellene fra det mucinøse miljøet. Hvordan kan cellene holdes levedyktige og skape en enkelt cellefjæring som ikke tetter strømningscytometeret? Basert på innledende arbeid av Pizzichini et al.30 og Miller et al.31, beskriver denne protokollen en enkel og pålitelig metode for sputumbehandling i en enkelt cellefjæring som er egnet for strømningscytometrisk analyse. Denne metoden har brukt veletablerte retningslinjer i flow cytometry32,33,34 for å utvikle en effektiv antistoffmerkingsstrategi for å identifisere hematopoietiske og epitelceller i sputum og gi instrumentinnstillinger, kvalitetskontrolltiltak og analyseretningslinjer som standardiserer sputumanalyse på en strømningscytometrisk plattform.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Sputum, som er mye brukt til å studere cellulært innhold og andre mikromiljøfunksjoner for å forstå lungens helse, analyseres tradisjonelt ved hjelp av cytologibaserte metoder. Verktøyet er begrenset fordi lesing av lysbildene er tidkrevende og krever høyt spesialisert personell. Videre gjør omfattende rusk og tilstedeværelsen av for mange squamous epitelceller (SECs), eller kinnceller, ofte en prøve utilstrekkelig for diagnose. I motsetning gir strømningscytometri mulighet for høy gjennomstrømning fenotyping av cellulære populasjoner samtidig som rusk og SECer utelates.
Protokollen som presenteres her beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon, antistoff flekk og fikse cellulære populasjoner, og skaffe prøver på en strømning cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver utelukkelse av rusk, døde celler (inkludert SECs) og celle dobler presenteres her. Videre forklarer dette arbeidet også hvordan man analyserer levedyktige, enkle sputumceller basert på en klynge av differensiering (CD) 45 positive og negative populasjoner for å karakterisere hematopoietiske og epiteliale avgrensningsundergrupper. Et kvalitetskontrolltiltak er også gitt ved å identifisere lungespesifikke makrofager som bevis på at en prøve er avledet fra lungen og ikke er spytt. Til slutt har det blitt demonstrert at denne metoden kan brukes på forskjellige cytometriske plattformer ved å gi sputumprofiler fra samme pasient analysert på tre strømningscytometere; Navios EX, LSR II og Lyric. Videre kan denne protokollen endres for å inkludere flere mobilmarkører av interesse. En metode for å analysere en hel sputumprøve på en strømningscytometrisk plattform presenteres her som gjør sputum egnet for å utvikle høygjennomstrømningsdiagnostikk av lungesykdom.

Denne protokollen ble utviklet med tanke på et klinisk laboratorium. Fokuset under utviklingen av protokollen var på enkelhet, effektivitet og reproduserbarhet. Det ble funnet at det mest tidkrevende trinnet i behandlingen av sputum telte cellene. Derfor er protokollen satt opp på en slik måte at sputumbehandling og cellemerking kan utføres uavhengig av celletelling uten tap av tid. Et nøyaktig celleantall, som fortsatt er nødvendig for å fortynne prøven på riktig måte for en uhindret løp, kan deretter oppnå...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon og den påfølgende karakteriseringen av cellulære delsett på standard flow cytometriske plattformer.

Kvalitetskontrollert sputumanalyse ved flowcytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Denne protokollen løser vanlige utfordringer med sputumbehandling som tidligere har gjort det vanskelig å bruke med strømningscytometri for klinisk diagnostiske formål med høy gjennomstrømning. Denne protokollen er designet for å spare tid ved å bruke sputumvekt for å bestemme antistoff og fargestofffargingsvolumer. Under fargingen kan celleantall utføres for nedstrømstrinnene.Det er viktig å oppnå et nøyaktig celleantall for å bestemme riktig re-suspensjonsvolum for å forhindre problemer når du kjører på strømningscytometeret. Denne protokollen kan gi innsikt i forskningsområder som undersøker lungehelsen. For eksempel kan sykdommer som kols, astma, lungekreft eller effekten av COVID studeres.Å demonstrere prosedyren vil være Dr.Michael Lai, en forsker og utviklingsforsker fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, vei sputumprøven for å bestemme volumene av dissosiasjonsreagenser. Overfør prøven til fartøyet med riktig størrelse basert på sputumvekten, og legg deretter til en milliliter per gram 0,5% NAC og fire milliliter per gram 0,1% DTT.Virvel prøvene med maksimal hastighet i 15 sekunder og rock med maksimal hastighet i 15 minutter ved romtemperatur. Fortynn denne prøven med 4X Hanks balansert saltoppløsning eller HBSS for å nøytralisere NAC og DTT. Og etter rask virveling, rock prøven ved romtemperatur i fem minutter.Filtrer cellefjæring gjennom en 100 mikrometer nylonnettcellesil i ett eller flere 50 milliliter koniske sentrifugerør for å skape en encellet suspensjon. Pellet ned cellene. Etter å ha aspirert supernatanten, kombiner pellets i ett 15 milliliter konisk rør og vask med HBSS under samme forhold.Resuspend cellepellet i et volum buffer bestemt av den opprinnelige vekten av sputumprøven. Ta en aliquot fra cellefjæringen og bland 10 mikroliter av sputumfortynning med 30 mikroliter 0,4% trypanblå, og last deretter inn i tellekamrene til et hemocytometer for et levende / dødt celleantall. Etikett sputum i kompensasjonsrør.Tilsett HBSS antistoff og fargestoff til hvert sputumcellerør og kompensasjonsrør som angitt i teksten. Legg sputumcellene til analyserørene og legg til kompensasjonsperler til kompensasjonsrørene som nevnt i teksten. Inkuber alle rørene på isen beskyttet mot lys i 35 minutter.Deretter etter å ha fylt rørene med iskald HBSS, sentrifuge på fire grader Celsius i 10 minutter ved 800 ganger G.For kompensasjonsrør, aspirer supernatanten så nær pelletsene som mulig og flikk pelletsene for å løsne. Deretter legger du til 0,5 milliliter kald HBSS til kompensasjonsrørene og lagrer rørene på isen i et lett beskyttet område til det er nødvendig for strømningscytometrianalyse. Aspirer deretter supernatanten fra sputumet unstained, isotype, blod og epitelrør.Løsne pelletsene ved å flikke rørene. Tilsett to milliliter 1%PFA til de uoppdagede og isotyperørene og 10 milliliter til blod- og epitelrørene. Inkuber rørene på is på en lys beskyttet måte i 30 minutter, deretter raskt virvel ved maksimal hastighet og igjen inkubere i ytterligere 30 minutter.Fyll deretter rørene med iskald HBSS. Deretter sentrifugerer rørene ved fire grader Celsius i 10 minutter ved 1600 ganger G.Aspirate så mye supernatant som mulig uten å forstyrre cellepellet og flikke røret med fingrene for å løsne cellene, og tilsett deretter 200 mikroliter kaldt HBSS til de uoppdagede og isotype rørene. Beregn og legg til det nødvendige volumet av HBSS for resuspension av blod og epitelrør i henhold til det totale celleantallet.Oppbevar alle prøvene i kompensasjonsrør beskyttet mot lys på isen ved fire grader Celsius til strømningscytometrianalysen utføres. Bruk passende oppstartsprosedyrer for strømningscytometeret som brukes. Bruk blandingen av National Institute of Standards and Technology eller NIST perler for å sikre at fremoverspredning og sidespredningsspenninger er satt til å plassere NIST-perlene for å spenne over tomten uten å plassere perlene for nær aksene.Sett strømningshastigheten til middels for LSRII eller høy for Navios EX. Juster spenningene for hver parameter som brukes for sprednings- og fluorescerende parametere for å plassere cellepopulasjonene i skala. Bruk tallene med gatingstrategien som veiledning for å justere spenningene deretter. Samle inn data for den unstained sputum prøven først, etterfulgt av isotype farget prøve, og deretter blodrøret og epitelrøret.Sputumvekt ble brukt til å bestemme antistoff eller fargevolumer for farging. Sammenhengen mellom sputumvekt og celleutbytte var ikke sterk. Sputumprøver ble delt inn i fire vektkategorier, som grupperte seg i fordelingen av celleutbytte.Hvert antistoff som ble brukt ble titrert i en konsentrasjon på platåfasen med den høyeste fargingsindeksen ble valgt som arbeidskonsentrasjon. I alle vektkategorier var den gjennomsnittlige SEC-forurensningen mindre enn 20%, med prosentandelen av levedyktige celler vist. Presentert er gating strategien som brukes til analyse.NIST-perler ble brukt til å sette en port som ble brukt på sputumprøven for å eliminere rusk. Små rusk ble ytterligere eliminert av breddeporten. Levedyktighetsfarge ble brukt til å eliminere døde celler, mens singlet gate fjernet dobler.Anti-CD45 antistoffmerking tillot separasjon av levende enkelt sputumceller i en blodcelle og et ikke-blodcellerom. Profilene hentet fra Navios EX, LSRII og Lyric ble sammenlignet. Gating strategien for å eliminere rusk, døde celler, dobler, og sammenligne blod og ikke-blod profiler er vist.Denne teknikken tillot oss å bruke disse metodene for å oppdage lungekreftrisiko for bruk som en ikke-invasiv klinisk test.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Tilpasning av semiautomated Sirkulasjons Tumor Cell (CTC) Analyser for klinisk og preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Innsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse av menneskelige endocervikale prøver

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereological og flowcytometrisystemer Karakterisering av Leukocytt subpopulasjoner i modeller av forbigående eller permanente Cerebral iskemi

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe Optimization fastslår Cell Dødelighet i en Photosynthetic Organism (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Ved hjelp av flowcytometri

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- og flowcytometrisystemer basert analyse av Cell Plasser og cellesyklus i 3D melanom Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodikk for Sputum induksjon og laboratoriet behandling

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Karakteristikk av immunceller i menneskelig fettvev ved hjelp av flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

En flyt cytometri-baserte analysen for å måle mitokondrie membran potensial i hjerte myocytter etter hypoksi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.