Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vil takke David Rodriguez for hans hjelp med figurforberedelsene. Sputumprøver ble kjørt på BD LSR II ved UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, støttet av UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC ved UT Health) og UL1 TR001120 (CTSA grant).

Alle trinn i sputumbehandlingen utføres i et biologisk sikkerhetsskap med passende personlig verneutstyr.
1. Reagensforberedelse før du starter sputum dissosiasjon
<ol><li>Tine 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prøve på is, og hold deg kald til bruk. FORSIKTIG: PFA er giftig ved innånding og hudkontakt. Forbered fikseringsmiddelet i henhold til produsentens instruksjoner og frys ved -20 °C i 25 ml aliquots til bruk.</li>
	<li>Omtrent vekten av prøven og tine nok 0,1% Dithiothreit...

Det cellulære innholdet av sputum inkluderer et stort utvalg av brede celler, ofte ledsaget av mye rusk37. I tillegg krever sputumanalyse en kvalitetskontroll som bekrefter at prøven samles inn fra lungen i stedet for munnhulen38. Derfor er det ikke så enkelt å analysere sputum ved strømningscytometri som det er for blod, for eksempel, som frigjør en mye renere og homogen cellefjæring. Denne protokollen har adressert alle disse problemene: å gi instrumentinnstilling...

Tekniske fremskritt innen maskinvare og programvare for flytcytometere har gjort det mulig å identifisere mange forskjellige cellepopulasjoner samtidig1,2,3,4. Utnyttelsen av strømningscytometeret i hematopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en mye bedre forståelse av immunsystemet2 og det cellulære hierarkiet i det hematopoietiske systemet5, samt det diagnostiske skillet mellom en rekke forskjellige blodkreft6,7,8. Selv om de fleste sputumceller er av hematopoietisk opprinnelse9,10,11, har strømningscytometri ikke blitt mye brukt på sputumanalyse for diagnostiske formål. Flere studier tyder imidlertid på at evalueringen av immuncellepopulasjoner i sputum (den viktigste undergruppen av celler) kan være til stor hjelp ved diagnostisering og/eller overvåking av sykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)12,13,14,15. Videre tillater eksistensen av epitelspesifikke markører som kan brukes i strømningscytometri forhør av følgende mest signifikante undergruppe av celler i sputum, lungeepitelceller.
I tillegg til evnen til å analysere mange forskjellige cellepopulasjoner av forskjellig vevsopprinnelse, kan et strømningscytometer evaluere et stort antall celler på relativt kort tid. Til sammenligning krever lysbildebaserte, cytologiske typer analyser ofte høyt spesialisert personell og/eller utstyr. Disse analysene kan være arbeidskrevende, noe som fører til at bare en andel av sputumprøven analyseres16.
Tre kritiske spørsmål begrenser den utbredte bruken av sputum i strømningscytometri. Det første problemet gjelder innsamling av sputum. Sputum samles gjennom en huff hoste som utviser slim fra lungene inn i munnhulen, og spytter deretter inn i en oppsamlingskopp. Siden slimet beveger seg gjennom munnhulen, er det stor sjanse for SEC-forurensning. Denne forurensningen kompliserer prøveanalysen, men problemet rettes lett på en strømningscytometrisk plattform, som vist i denne studien.
Ikke alle kan produsere sputum spontant; Derfor er flere enheter utviklet for å hjelpe til med sputumsamlingen på en ikke-invasiv måte17. Forstøveren er en slik enhet og har vist seg å produsere pålitelige sputumprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en svært effektiv måte å ikke invasivt samle sputum på, krever bruken fortsatt en innstilling på et medisinsk anlegg med spesialisert personell21. I motsetning til dette kan håndholdte enheter som lungefløyten22,23,24 og acapella16,25 brukes hjemme siden de er veldig brukervennlige. Disse hjelpeenhetene er både trygge og kostnadseffektive.
For oss ga acapella konsekvent bedre resultater enn lungefløyten16, og derfor er acapella-enheten valgt for sputumsamlinger. En 3-dagers samlingsprøve ble bestemt fordi hovedformålet med bruk av sputum er å utvikle en lungekreftdeteksjonstest16. Det har vist seg at en 3-dagers prøve øker sannsynligheten for lungekreftdeteksjon sammenlignet med en 1- eller 2-dagers prøve26,27,28. Imidlertid kan andre metoder for sputumsamling være å foretrekke for forskjellige formål. Hvis en annen sputumoppsamlingsmetode brukes enn den som er beskrevet her, anbefales det å nøye titrate hvert antistoff eller fargestoff som brukes til strømningscytometrisk analyse; svært lite data er tilgjengelig om hvordan ulike sputuminnsamlingsmetoder påvirker de målrettede proteinene for strømningscytometri.
Det andre problemet som demper entusiasmen for å bruke sputum for diagnostikk, hovedsakelig relatert til strømningscytometri, er cellenummer. Problemet er innsamling av tilstrekkelige levedyktige celler for en pålitelig analyse. To studier viste at sputumprøver samlet inn ved ikke-invasive metoder, ved hjelp av en hjelpeenhet, inneholder nok levedyktige celler som kan brukes i klinisk diagnose eller forskningsstudier16,24. Imidlertid tok ingen av disse studiene opp spørsmålet om celletall angående strømningscytometri.
For studiene som danner grunnlaget for denne protokollen, ble det samlet inn sputumprøver fra deltakere med høy risiko for å utvikle lungekreft etter godkjente institusjonelle retningslinjer for hvert studiested. Høyrisikodeltakere ble definert som mellom 55-75 år, etter å ha røkt 30 pakkeår og ikke sluttet å røyke i løpet av de siste 15 årene. Pasienter ble vist hvordan man bruker acapella-enheten i henhold til produsentens instruksjoner29 og samlet sputum i tre påfølgende dager hjemme. Prøven ble oppbevart i kjøleskapet til siste oppsamling. På den siste innsamlingsdagen ble prøven sendt til laboratoriet over natten med en frossen kald pakke. Prøvene ble behandlet til en enkelt celle suspensjon den dagen de ble mottatt. Med denne metoden for sputumsamling oppnås mer enn nok levedyktige celler for en pålitelig strømningscytometrisk analyse.
Til slutt, og relatert til det forrige cellenummerproblemet, er spørsmålet om hvordan du frigjør sputumcellene fra det mucinøse miljøet. Hvordan kan cellene holdes levedyktige og skape en enkelt cellefjæring som ikke tetter strømningscytometeret? Basert på innledende arbeid av Pizzichini et al.30 og Miller et al.31, beskriver denne protokollen en enkel og pålitelig metode for sputumbehandling i en enkelt cellefjæring som er egnet for strømningscytometrisk analyse. Denne metoden har brukt veletablerte retningslinjer i flow cytometry32,33,34 for å utvikle en effektiv antistoffmerkingsstrategi for å identifisere hematopoietiske og epitelceller i sputum og gi instrumentinnstillinger, kvalitetskontrolltiltak og analyseretningslinjer som standardiserer sputumanalyse på en strømningscytometrisk plattform.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Sputum, som er mye brukt til å studere cellulært innhold og andre mikromiljøfunksjoner for å forstå lungens helse, analyseres tradisjonelt ved hjelp av cytologibaserte metoder. Verktøyet er begrenset fordi lesing av lysbildene er tidkrevende og krever høyt spesialisert personell. Videre gjør omfattende rusk og tilstedeværelsen av for mange squamous epitelceller (SECs), eller kinnceller, ofte en prøve utilstrekkelig for diagnose. I motsetning gir strømningscytometri mulighet for høy gjennomstrømning fenotyping av cellulære populasjoner samtidig som rusk og SECer utelates.
Protokollen som presenteres her beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon, antistoff flekk og fikse cellulære populasjoner, og skaffe prøver på en strømning cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver utelukkelse av rusk, døde celler (inkludert SECs) og celle dobler presenteres her. Videre forklarer dette arbeidet også hvordan man analyserer levedyktige, enkle sputumceller basert på en klynge av differensiering (CD) 45 positive og negative populasjoner for å karakterisere hematopoietiske og epiteliale avgrensningsundergrupper. Et kvalitetskontrolltiltak er også gitt ved å identifisere lungespesifikke makrofager som bevis på at en prøve er avledet fra lungen og ikke er spytt. Til slutt har det blitt demonstrert at denne metoden kan brukes på forskjellige cytometriske plattformer ved å gi sputumprofiler fra samme pasient analysert på tre strømningscytometere; Navios EX, LSR II og Lyric. Videre kan denne protokollen endres for å inkludere flere mobilmarkører av interesse. En metode for å analysere en hel sputumprøve på en strømningscytometrisk plattform presenteres her som gjør sputum egnet for å utvikle høygjennomstrømningsdiagnostikk av lungesykdom.

Denne protokollen ble utviklet med tanke på et klinisk laboratorium. Fokuset under utviklingen av protokollen var på enkelhet, effektivitet og reproduserbarhet. Det ble funnet at det mest tidkrevende trinnet i behandlingen av sputum telte cellene. Derfor er protokollen satt opp på en slik måte at sputumbehandling og cellemerking kan utføres uavhengig av celletelling uten tap av tid. Et nøyaktig celleantall, som fortsatt er nødvendig for å fortynne prøven på riktig måte for en uhindret løp, kan deretter oppnå...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon og den påfølgende karakteriseringen av cellulære delsett på standard flow cytometriske plattformer.

Kvalitetskontrollert sputumanalyse ved flowcytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Denne protokollen løser vanlige utfordringer med sputumbehandling som tidligere har gjort det vanskelig å bruke med strømningscytometri for klinisk diagnostiske formål med høy gjennomstrømning. Denne protokollen er designet for å spare tid ved å bruke sputumvekt for å bestemme antistoff og fargestofffargingsvolumer. Under fargingen kan celleantall utføres for nedstrømstrinnene.Det er viktig å oppnå et nøyaktig celleantall for å bestemme riktig re-suspensjonsvolum for å forhindre problemer når du kjører på strømningscytometeret. Denne protokollen kan gi innsikt i forskningsområder som undersøker lungehelsen. For eksempel kan sykdommer som kols, astma, lungekreft eller effekten av COVID studeres.Å demonstrere prosedyren vil være Dr.Michael Lai, en forsker og utviklingsforsker fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, vei sputumprøven for å bestemme volumene av dissosiasjonsreagenser. Overfør prøven til fartøyet med riktig størrelse basert på sputumvekten, og legg deretter til en milliliter per gram 0,5% NAC og fire milliliter per gram 0,1% DTT.Virvel prøvene med maksimal hastighet i 15 sekunder og rock med maksimal hastighet i 15 minutter ved romtemperatur. Fortynn denne prøven med 4X Hanks balansert saltoppløsning eller HBSS for å nøytralisere NAC og DTT. Og etter rask virveling, rock prøven ved romtemperatur i fem minutter.Filtrer cellefjæring gjennom en 100 mikrometer nylonnettcellesil i ett eller flere 50 milliliter koniske sentrifugerør for å skape en encellet suspensjon. Pellet ned cellene. Etter å ha aspirert supernatanten, kombiner pellets i ett 15 milliliter konisk rør og vask med HBSS under samme forhold.Resuspend cellepellet i et volum buffer bestemt av den opprinnelige vekten av sputumprøven. Ta en aliquot fra cellefjæringen og bland 10 mikroliter av sputumfortynning med 30 mikroliter 0,4% trypanblå, og last deretter inn i tellekamrene til et hemocytometer for et levende / dødt celleantall. Etikett sputum i kompensasjonsrør.Tilsett HBSS antistoff og fargestoff til hvert sputumcellerør og kompensasjonsrør som angitt i teksten. Legg sputumcellene til analyserørene og legg til kompensasjonsperler til kompensasjonsrørene som nevnt i teksten. Inkuber alle rørene på isen beskyttet mot lys i 35 minutter.Deretter etter å ha fylt rørene med iskald HBSS, sentrifuge på fire grader Celsius i 10 minutter ved 800 ganger G.For kompensasjonsrør, aspirer supernatanten så nær pelletsene som mulig og flikk pelletsene for å løsne. Deretter legger du til 0,5 milliliter kald HBSS til kompensasjonsrørene og lagrer rørene på isen i et lett beskyttet område til det er nødvendig for strømningscytometrianalyse. Aspirer deretter supernatanten fra sputumet unstained, isotype, blod og epitelrør.Løsne pelletsene ved å flikke rørene. Tilsett to milliliter 1%PFA til de uoppdagede og isotyperørene og 10 milliliter til blod- og epitelrørene. Inkuber rørene på is på en lys beskyttet måte i 30 minutter, deretter raskt virvel ved maksimal hastighet og igjen inkubere i ytterligere 30 minutter.Fyll deretter rørene med iskald HBSS. Deretter sentrifugerer rørene ved fire grader Celsius i 10 minutter ved 1600 ganger G.Aspirate så mye supernatant som mulig uten å forstyrre cellepellet og flikke røret med fingrene for å løsne cellene, og tilsett deretter 200 mikroliter kaldt HBSS til de uoppdagede og isotype rørene. Beregn og legg til det nødvendige volumet av HBSS for resuspension av blod og epitelrør i henhold til det totale celleantallet.Oppbevar alle prøvene i kompensasjonsrør beskyttet mot lys på isen ved fire grader Celsius til strømningscytometrianalysen utføres. Bruk passende oppstartsprosedyrer for strømningscytometeret som brukes. Bruk blandingen av National Institute of Standards and Technology eller NIST perler for å sikre at fremoverspredning og sidespredningsspenninger er satt til å plassere NIST-perlene for å spenne over tomten uten å plassere perlene for nær aksene.Sett strømningshastigheten til middels for LSRII eller høy for Navios EX. Juster spenningene for hver parameter som brukes for sprednings- og fluorescerende parametere for å plassere cellepopulasjonene i skala. Bruk tallene med gatingstrategien som veiledning for å justere spenningene deretter. Samle inn data for den unstained sputum prøven først, etterfulgt av isotype farget prøve, og deretter blodrøret og epitelrøret.Sputumvekt ble brukt til å bestemme antistoff eller fargevolumer for farging. Sammenhengen mellom sputumvekt og celleutbytte var ikke sterk. Sputumprøver ble delt inn i fire vektkategorier, som grupperte seg i fordelingen av celleutbytte.Hvert antistoff som ble brukt ble titrert i en konsentrasjon på platåfasen med den høyeste fargingsindeksen ble valgt som arbeidskonsentrasjon. I alle vektkategorier var den gjennomsnittlige SEC-forurensningen mindre enn 20%, med prosentandelen av levedyktige celler vist. Presentert er gating strategien som brukes til analyse.NIST-perler ble brukt til å sette en port som ble brukt på sputumprøven for å eliminere rusk. Små rusk ble ytterligere eliminert av breddeporten. Levedyktighetsfarge ble brukt til å eliminere døde celler, mens singlet gate fjernet dobler.Anti-CD45 antistoffmerking tillot separasjon av levende enkelt sputumceller i en blodcelle og et ikke-blodcellerom. Profilene hentet fra Navios EX, LSRII og Lyric ble sammenlignet. Gating strategien for å eliminere rusk, døde celler, dobler, og sammenligne blod og ikke-blod profiler er vist.Denne teknikken tillot oss å bruke disse metodene for å oppdage lungekreftrisiko for bruk som en ikke-invasiv klinisk test.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Tilpasning av semiautomated Sirkulasjons Tumor Cell (CTC) Analyser for klinisk og preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Innsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse av menneskelige endocervikale prøver

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Stereological og flowcytometrisystemer Karakterisering av Leukocytt subpopulasjoner i modeller av forbigående eller permanente Cerebral iskemi

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization fastslår Cell Dødelighet i en Photosynthetic Organism (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Ved hjelp av flowcytometri

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- og flowcytometrisystemer basert analyse av Cell Plasser og cellesyklus i 3D melanom Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Metodikk for Sputum induksjon og laboratoriet behandling

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakteristikk av immunceller i menneskelig fettvev ved hjelp av flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

En flyt cytometri-baserte analysen for å måle mitokondrie membran potensial i hjerte myocytter etter hypoksi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...