Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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Queremos agradecer a David Rodriguez por sua ajuda com a preparação da figura. As amostras de sputum foram realizadas no BD LSR II no UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, apoiado pela UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (bolsa CTSA).

Todas as etapas do processamento de escarro são realizadas em um gabinete de segurança biológica com equipamentos de proteção individual adequados.
1. Preparação do reagente antes de iniciar a dissociação do escarro
<ol><li>Descongele 1% Paraformaldeído (PFA), 25 mL por amostra no gelo e mantenha frio até o uso. ATENÇÃO: O PFA é tóxico por inalação e contato com a pele. Prepare o fixador de acordo com as instruções do fabricante e congele a -20 °C em alíquotas de 25 m...

O conteúdo celular da escarro inclui uma grande variedade de células amplas, muitas vezes acompanhadas por muitos detritos37. Além disso, a análise da escarro requer um controle de qualidade que confirme que a amostra é coletada do pulmão em vez da cavidade oral38. Portanto, não é tão simples analisar a escarro por citometria de fluxo como é para o sangue, por exemplo, que libera uma suspensão celular muito mais limpa e homogênea. Este protocolo abordou todas es...

Os avanços técnicos no hardware e software de citómetros de fluxo permitiram identificar muitas populações celulares distintas simultaneamente1,2,3,4. A utilização do citómetro de fluxo na pesquisa de células hematopoiéticas, por exemplo, levou a uma compreensão muito melhor do sistema imunológico2 e da hierarquia celular do sistema hematopoiético5, bem como a distinção diagnóstica de uma infinidade de diferentes cânceres sanguíneos6,7,8. Embora a maioria das células de escarro sejam de origem hematopoiética9,10,11, a citometria de fluxo não tem sido amplamente aplicada à análise de escarro para fins diagnósticos. No entanto, vários estudos sugerem que a avaliação das populações de células imunes na escarro (o subconjunto mais significativo de células) pode ser de grande ajuda no diagnóstico e/ou monitoramento de doenças como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)12,13,14,15. Além disso, a existência de marcadores epiteliais específicos que podem ser usados na citometria de fluxo permite o interrogatório do subconjunto mais significativo de células em escarro, células epiteliais pulmonares.
Além da capacidade de analisar muitas populações celulares distintas de diferentes origens teciduais, um citômetro de fluxo pode avaliar um grande número de células em um período relativamente curto. Em comparação, os tipos de análises cológicas baseadas em slides muitas vezes requerem pessoal e/ou equipamento altamente especializados. Essas análises podem ser intensivas em mão-de-obra, o que leva a apenas uma proporção da amostra de escarro que está sendo analisada16.
Três questões críticas limitam o uso generalizado de escarro na citometria de fluxo. A primeira questão diz respeito à coleta de escarro. A saliva é coletada através de uma tosse que expele muco dos pulmões para a cavidade oral, posteriormente cuspindo em um copo de coleta. Uma vez que o muco viaja através da cavidade oral, há uma alta chance de contaminação sec. Essa contaminação complica a análise da amostra, mas o problema é facilmente corrigido em uma plataforma citométrica de fluxo, como mostrado neste estudo.
Nem todo mundo pode produzir escarro espontaneamente; por isso, vários dispositivos foram desenvolvidos para auxiliar na coleta de escarro de forma não invasiva17. O nebulizador é um desses dispositivos e tem sido mostrado para produzir amostras de escarro confiáveis18,19,20. Embora o nebulizador seja uma forma muito eficaz de coleta não invasiva, seu uso ainda requer uma configuração em uma instalação médica com pessoal especializado21. Em contraste, dispositivos portáteis como a flauta pulmonar22,23,24 e o acapella16,25 podem ser usados em casa, pois são muito fáceis de usar. Estes dispositivos de assistência são seguros e econômicos.
Para nós, a acapella deu resultados consistentemente melhores do que a flauta pulmonar16 e, portanto, o dispositivo de acapella foi escolhido para coleções de escarro. Uma amostra de coleta de 3 dias foi decidida porque o objetivo principal do uso de escarro é desenvolver um teste de detecção de câncer de pulmão16. Foi demonstrado que uma amostra de 3 dias aumenta a probabilidade de detecção de câncer de pulmão em comparação com uma amostra de 1 ou 2 dias26,27,28. No entanto, outros métodos de coleta de escarro podem ser preferíveis para diferentes propósitos. Se um método de coleta de escarro diferente for utilizado do que o descrito aqui, recomenda-se titular cuidadosamente cada anticorpo ou corante usado para análise citométrica de fluxo; muito poucos dados estão disponíveis sobre como diferentes métodos de coleta de escarro afetam as proteínas-alvo para citometria de fluxo.
A segunda questão que amortece o entusiasmo pelo uso de escarro para diagnósticos, principalmente relacionados à citometria de fluxo, é o número de células. O problema é a coleta de células viáveis suficientes para uma análise confiável. Dois estudos demonstraram que amostras de escarro coletadas por métodos não invasivos, com a ajuda de um dispositivo auxiliar, contêm células viáveis suficientes que podem ser utilizadas em diagnóstico clínico ou estudos de pesquisa16,24. No entanto, nenhum desses estudos abordou a questão dos números celulares relativos à citometria de fluxo.
Para os estudos que formam a base para este protocolo, foram coletadas amostras de escarro de participantes de alto risco para o desenvolvimento de câncer de pulmão seguindo diretrizes institucionais aprovadas para cada local de estudo. Os participantes de alto risco foram definidos entre 55 e 75 anos, tendo fumado 30 anos de embalagem e não ter parado de fumar nos últimos 15 anos. Os pacientes foram mostrados como usar o dispositivo de acapella de acordo com as instruções do fabricante29 e coletaram escarro por três dias consecutivos em casa. A amostra foi mantida na geladeira até a última coleta. No último dia de coleta, a amostra foi enviada ao laboratório durante a noite com um pacote frio congelado. As amostras foram processadas em uma única suspensão celular no dia em que foram recebidas. Com este método de coleta de escarro, mais do que suficientes células viáveis são obtidas para uma análise citométrica de fluxo confiável.
Por fim, e relacionado com a emissão anterior do número de células, é a questão de como liberar as células de escarro de seu ambiente mucinoso. Como as células podem ser mantidas viáveis e criar uma única suspensão celular que não obstrua o citómetro de fluxo? Baseado no trabalho inicial de Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, este protocolo descreve um método fácil e confiável para o processamento de escarro em uma única suspensão celular adequada para análise citométrica de fluxo. Este método tem utilizado diretrizes bem estabelecidas na citometria de fluxo32,33,34 para desenvolver uma estratégia eficiente de rotulagem de anticorpos para identificar células hematopoiéticas e epiteliais em escarro e fornecer configurações de instrumentos, medidas de controle de qualidade e diretrizes de análise padronizando a análise de escarro em uma plataforma citométrica de fluxo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

O sputum, amplamente utilizado para estudar o conteúdo celular e outras características microambientais para entender a saúde do pulmão, é tradicionalmente analisado por meio de metodologias baseadas em citologia. Sua utilidade é limitada porque a leitura dos slides é demorada e requer pessoal altamente especializado. Além disso, detritos extensos e a presença de muitas células epiteliais escamosas (SECs), ou células da bochecha, muitas vezes torna uma amostra inadequada para o diagnóstico. Em contraste, a citometria de fluxo permite fenotipagem de alto rendimento de populações celulares, excluindo simultaneamente detritos e SECs.
O protocolo aqui apresentado descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular, mancha de anticorpos e fixar populações celulares, e adquirir amostras em uma plataforma citométrica de fluxo. Uma estratégia de gating que descreve a exclusão de detritos, células mortas (incluindo SECs) e doublets de células é apresentada aqui. Além disso, este trabalho também explica como analisar células de escarro única viáveis baseadas em um aglomerado de diferenciação (CD)45 populações positivas e negativas para caracterizar subconjuntos de linhagem hematopoiética e epitelial. Uma medida de controle de qualidade também é fornecida pela identificação de macrófagos específicos do pulmão como evidência de que uma amostra é derivada do pulmão e não é saliva. Finalmente, foi demonstrado que este método pode ser aplicado a diferentes plataformas citométricas, fornecendo perfis de escarro do mesmo paciente analisado em três citómetros de fluxo; Navios EX, LSR II e Lyric. Além disso, este protocolo pode ser modificado para incluir marcadores celulares adicionais de interesse. Um método para analisar uma amostra de escarro inteira em uma plataforma citométrica de fluxo é apresentado aqui que torna a escarro favorável para o desenvolvimento de diagnósticos de alta produtividade de doenças pulmonares.

Este protocolo foi desenvolvido com um ambiente de laboratório clínico em mente. O foco durante o desenvolvimento do protocolo foi a simplicidade, eficiência e reprodutibilidade. Verificou-se que o passo mais demorado no processamento da escarro era contar as células. Portanto, o protocolo é configurado de tal forma que o processamento de escarro e rotulagem celular possam ser realizados independentemente da contagem celular sem perda de tempo. Uma contagem de células precisa, que ainda é necessária para diluir a...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.

Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Este protocolo resolve desafios comuns experimentados com o processamento de escarro que tornaram difícil no passado o uso com citometria de fluxo para fins de diagnóstico clínico de alto rendimento. Este protocolo foi projetado para economizar tempo usando peso de escarro para determinar volumes de manchas de anticorpos e corantes. Durante a incubação de manchas, a contagem de células pode ser realizada para as etapas a jusante.É importante obter uma contagem de células precisa para determinar o volume correto de re-suspensão para evitar quaisquer problemas ao executar no cítmetro de fluxo. Este protocolo pode fornecer informações sobre áreas de pesquisa que investigam a saúde pulmonar. Por exemplo, doenças como DPOC, asma, câncer de pulmão ou os efeitos do COVID poderiam ser estudadas.Demonstrando o procedimento estará o Dr. Michael Lai, um cientista de pesquisa e desenvolvimento do meu laboratório. Para começar, pese a amostra de escarro para determinar os volumes dos reagentes de dissociação. Transfira a amostra para o vaso de tamanho apropriado com base no peso da escarro, em seguida, adicione um mililitro por grama de 0,5% NAC e quatro mililitros por grama de 0,1%DTT.Vórtice as amostras em velocidade máxima por 15 segundos e rocha a velocidade máxima por 15 minutos à temperatura ambiente. Diluir esta amostra com a solução de sal balanceada 4X Hanks ou HBSS para neutralizar o NAC e o DTT. E depois de um rápido vórtice, balance a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos.Filtrar a suspensão celular através de um coador de células de malha de nylon de 100 micrômetros em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros para criar uma suspensão unicelular. Pelota pelas celas. Depois de aspirar o supernasce, combine pelotas em um tubo cônico de 15 mililitros e lave com HBSS nas mesmas condições.Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro. Pegue uma alíquota da suspensão celular e misture 10 microlitres da diluição da escarro com 30 microliters de azul trypan de 0,4%, em seguida, carregue nas câmaras de contagem de um hemocitômetro para uma contagem de células vivas/mortas. Etiquetar escarro em tubos de compensação.Adicione anticorpo HBSS e corante a cada tubo de célula de escarro e tubos de compensação conforme indicado no texto. Adicione as células de escarro aos tubos de ensaio e adicione contas de compensação aos tubos de compensação mencionados no texto. Incubar todos os tubos no gelo protegidos da luz por 35 minutos.Em seguida, depois de encher os tubos com HBSS gelado, centrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos a 800 vezes G.Para tubos de compensação, aspire o supernatante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de HBSS frios aos tubos de compensação e armazene os tubos no gelo em uma área protegida por luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo. Em seguida, aspire o supernatante da escarro sem manchas, isótipo, sangue e tubos epiteliais.Solte as pelotas apertando os tubos. Adicione dois mililitros de 1%PFA aos tubos de isótipo e isótipo não contidos e 10 mililitros ao sangue e tubos epiteliais. Incubar os tubos no gelo de forma protegida pela luz por 30 minutos, depois rapidamente vórtice em velocidade máxima e incubar novamente por mais 30 minutos.Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, centrifugar os tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.600 vezes G.Aspirar o máximo de supernascer possível sem perturbar a pelota celular e mexer o tubo com os dedos para soltar as células, em seguida, adicionar 200 microliters de HBSS frios aos tubos não manchados e isótipo. Calcule e adicione o volume necessário de HBSS para a ressuspensão do sangue e do tubo epitelial de acordo com a contagem total de células.Armazene todas as amostras em tubos de compensação protegidos da luz no gelo a quatro graus Celsius até que a análise da citometria de fluxo seja realizada. Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado. Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia ou NIST para garantir que as tensões de dispersão dianteira e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos.Defina a taxa de fluxo para médio para LSRII ou alta para Navios EX. Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares em escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação para ajustar as tensões de acordo. Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial.O peso da escória foi usado para determinar os volumes de anticorpos ou corantes para coloração. A correlação entre peso de escarro e rendimento celular não foi forte. As amostras de escarro foram divididas em quatro categorias de peso, agrupadas na distribuição do rendimento celular.Cada anticorpo utilizado foi titulado em uma concentração na fase do planalto com o maior índice de coloração foi escolhido como concentração de trabalho. Em todas as categorias de peso, a contaminação média da SEC foi inferior a 20% com o percentual de células viáveis mostradas. Apresentada é a estratégia de gating utilizada para análise.Contas NIST foram usadas para definir um portão que foi aplicado à amostra de escarro para eliminar detritos. Pequenos detritos foram ainda eliminados pelo portão de largura. O corante de viabilidade foi usado para eliminar células mortas, enquanto o portão singlet removeu doublets.A rotulagem de anticorpos anti-CD45 permitiu a separação de células de escarro única vivas em uma célula sanguínea e um compartimento de células não-sanguíneas. Os perfis obtidos entre Navios EX, LSRII e Lyric foram comparados. A estratégia de gating para eliminar os detritos, células mortas, dobras e comparar perfis sanguíneos e não-sanguíneos é mostrada.Esta técnica nos permitiu aplicar esses métodos para detectar o risco de câncer de pulmão para uso como um teste clínico não invasivo.

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