Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Хотим поблагодарить Давида Родригеса за помощь в подготовке фигуры. Образцы мокроты были запущены на BD LSR II в UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility при поддержке UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) и UL1 TR001120 (грант CTSA).

Все этапы обработки мокроты выполняются в шкафу биологической безопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
1. Подготовка реагентов перед началом диссоциации мокроты
<ol><li>Разморозьте 1% параформальдегида (PFA), 25 мл на образец на льду, и держите холод?...

Клеточное содержание мокроты включает в себя большое разнообразие обширных клеток, часто сопровождающихся большим количеством мусора37. Кроме того, анализ мокроты требует контроля качества, который подтверждает, что образец взят из легкого, а не из ротовой полос?...

Технические достижения в аппаратном и программном обеспечении проточных цитометров позволили идентифицировать множество различных клеточных популяций одновременно1,2,3,4. Например, использование проточного цитометра в исследованиях гемопоэтических клеток привело к гораздо лучшему пониманию иммунной системы2 и клеточной иерархии кроветворной системы5, а также к диагностическому различию множества различных видов рака крови6,7,8. Хотя большинство клеток мокроты имеют кроветворное происхождение9,10,11, проточная цитометрия не получила широкого применения для анализа мокроты в диагностических целях. Тем не менее, несколько исследований показывают, что оценка популяций иммунных клеток в мокроте (наиболее значительное подмножество клеток) может оказать большую помощь в диагностике и / или мониторинге таких заболеваний, как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) 12,13,14,15. Более того, наличие эпителиально-специфических маркеров, которые могут быть использованы в проточной цитометрии, позволяет опрашивать следующие наиболее значимые подмножества клеток в мокроте, эпителиальные клетки легких.
В дополнение к способности анализировать множество различных клеточных популяций различного происхождения тканей, проточный цитометр может оценивать большое количество клеток за относительно короткий период. Для сравнения, цитологические виды анализов на основе слайдов часто требуют узкоспециализированного персонала и/или оборудования. Эти анализы могут быть трудоемкими, что приводит к анализу только части образца мокроты16.
Три критических вопроса ограничивают широкое использование мокроты в проточной цитометрии. Первый вопрос касается сбора мокроты. Мокрота собирается через кашель, который выталкивает слизь из легких в ротовую полость, впоследствии плевая в чашку для сбора. Поскольку слизь проходит через ротовую полость, существует высокая вероятность загрязнения SEC. Это загрязнение усложняет анализ образцов, но проблема легко устраняется на проточной цитометрической платформе, как показано в этом исследовании.
Не каждый может производить мокроту спонтанно; поэтому было разработано несколько устройств для оказания помощи в сборе мокроты неинвазивным способом17. Небулайзер является одним из таких устройств и, как было показано, производит надежные образцы мокроты18,19,20. Хотя небулайзер является очень эффективным способом неинвазивного сбора мокроты, его использование все же требует установки в медицинском учреждении со специализированным персоналом21. Напротив, портативные устройства, такие как легочная флейта22,23,24 и acapella16,25, могут использоваться дома, поскольку они очень удобны для пользователя. Эти вспомогательные устройства безопасны и экономичны.
Для нас акапелла давала стабильно лучшие результаты, чем легочная флейта16, и поэтому для сбора мокроты было выбрано устройство акапеллы. Было принято решение о 3-дневном сборе образца, поскольку основной целью использования мокроты является разработка теста на выявление рака легких16. Было показано, что 3-дневный образец увеличивает вероятность обнаружения рака легких по сравнению с 1- или 2-дневным образцом26,27,28. Однако другие методы сбора мокроты могут быть предпочтительнее для других целей. Если используется другой метод сбора мокроты, чем описанный здесь, рекомендуется тщательно титровать каждое антитело или краситель, используемый для проточного цитометрического анализа; имеется очень мало данных о том, как различные методы сбора мокроты влияют на целевые белки для проточной цитометрии.
Второй проблемой, ослабляющей энтузиазм по поводу использования мокроты для диагностики, в первую очередь связанной с проточной цитометрией, является количество клеток. Проблема заключается в сборе достаточного количества жизнеспособных клеток для достоверного анализа. Два исследования показали, что образцы мокроты, собранные неинвазивными методами с помощью вспомогательного устройства, содержат достаточно жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы в клинической диагностике или научных исследованиях16,24. Однако ни в одном из этих исследований не рассматривался вопрос о количестве клеток, касающихся проточной цитометрии.
Для исследований, которые составляют основу для этого протокола, образцы мокроты были собраны у участников с высоким риском развития рака легких в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами для каждого места исследования. Участники с высоким риском были определены как люди в возрасте от 55 до 75 лет, курившие 30 лет и не бросившие курить в течение последних 15 лет. Пациентам показывали, как использовать аппарат акапеллы согласно инструкции производителя29 и собирали мокроту в течение трех дней подряд в домашних условиях. Образец хранился в холодильнике до последнего сбора. В последний день сбора образец был отправлен в лабораторию на ночь с замороженным холодным пакетом. Образцы были обработаны в одноклеточную суспензию в день их получения. При таком методе сбора мокроты получается более чем достаточно жизнеспособных клеток для надежного проточного цитометрического анализа.
Наконец, и в связи с предыдущей проблемой с номером клеток, является вопрос о том, как освободить клетки мокроты из муцинозной среды. Как сохранить жизнеспособность клеток и создать одноклеточную суспензию, которая не засоряет проточный цитометр? Основываясь на первоначальной работе Pizzichini et al.30 и Miller et al.31, этот протокол описывает простой и надежный метод обработки мокроты в одноклеточную суспензию, которая подходит для проточного цитометрического анализа. Этот метод использовал хорошо зарекомендовавшие себя руководящие принципы в проточной цитометрии32,33,34 для разработки эффективной стратегии маркировки антител для идентификации гемопоэтических и эпителиальных клеток в мокроте и предоставления настроек приборов, мер контроля качества и руководящих принципов анализа, стандартизирующих анализ мокроты на проточной цитометрической платформе.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Мокрота, широко используемая для изучения клеточного содержания и других микроокружающих особенностей для понимания здоровья легких, традиционно анализируется с использованием методологий, основанных на цитологии. Его полезность ограничена, потому что чтение слайдов отнимает много времени и требует узкоспециализированного персонала. Кроме того, обширный мусор и наличие слишком большого количества плоских эпителиальных клеток (STEC) или клеток щек часто делают образец неадекватным для диагностики. Напротив, проточная цитометрия позволяет осуществлять высокопроизводительное фенотипирование клеточных популяций, одновременно исключая мусор и СЭК.
Протокол, представленный здесь, описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одну клеточную суспензию, окрашивания антител и фиксации клеточных популяций, а также получения образцов на проточной цитометрической платформе. Здесь представлена стратегия гатинга, которая описывает исключение мусора, мертвых клеток (включая SEC) и дублетов клеток. Кроме того, эта работа также объясняет, как анализировать жизнеспособные одиночные клетки мокроты на основе кластера дифференцировки (CD) 45 положительных и отрицательных популяций для характеристики подмножеств кроветворной и эпителиальной линии. Мера контроля качества также обеспечивается путем идентификации специфических для легких макрофагов в качестве доказательства того, что образец получен из легкого и не является слюной. Наконец, было продемонстрировано, что этот метод может быть применен к различным цитометрическим платформам путем предоставления профилей мокроты от одного и того же пациента, проанализированных на трех проточных цитометрах; Navios EX, LSR II и Lyric. Кроме того, этот протокол может быть модифицирован для включения дополнительных клеточных маркеров, представляющих интерес. Здесь представлен метод анализа целого образца мокроты на проточной цитометрической платформе, что делает мокроту пригодной для разработки высокопроизводительной диагностики заболеваний легких.

Этот протокол был разработан с учетом клинических лабораторных условий. При разработке протокола основное внимание уделялось простоте, эффективности и воспроизводимости. Было установлено, что самым трудоемким этапом в обработке мокроты был подсчет клеток. Поэтому протокол настроен ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.

Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Этот протокол решает общие проблемы, возникающие при обработке мокроты, которые в прошлом затрудняли использование с проточной цитометрией для высокопроизводительных клинических диагностических целей. Этот протокол предназначен для экономии времени за счет использования веса мокроты для определения объемов окрашивания антител и красителей. Во время окрашивания инкубации может быть выполнен подсчет клеток для последующих этапов.Важно достичь точного количества клеток, чтобы определить правильный объем повторной суспензии, чтобы предотвратить любые проблемы при работе на проточном цитометре. Этот протокол может дать представление о областях исследований, которые исследуют здоровье легких. Например, могут быть изучены такие заболевания, как ХОБЛ, астма, рак легких или последствия COVID.Демонстрировать процедуру будет доктор Майкл Лай, ученый-исследователь из моей лаборатории. Для начала взвесьте образец мокроты, чтобы определить объемы диссоциационных реагентов. Перенесите образец в сосуд соответствующего размера в зависимости от веса мокроты, затем добавьте один миллилитр на грамм 0,5% NAC и четыре миллилитра на грамм 0,1% DTT.Вращайте образцы на максимальной скорости в течение 15 секунд и породу на максимальной скорости в течение 15 минут при комнатной температуре. Разбавьте этот образец 4X сбалансированным солевым раствором Хэнкса или HBSS для нейтрализации NAC и DTT. А после быстрого вихря качайте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.Фильтрационная клеточная суспензия через 100-микрометровый нейлоновый сетчатый сетчатый фильтр в одну или несколько конических центрифужных трубок по 50 миллилитрам для создания одноэлектрической суспензии. Гранулируйте ячейки. После аспирации супернатанта смешайте гранулы в одной конической трубке объемом 15 миллилитров и промывайте HBSS в тех же условиях.Повторно суспендируют ячейку гранулы в объеме буфера, определяемом начальным весом образца мокроты. Возьмите аликвоту из клеточной суспензии и смешайте 10 микролитров разведения мокроты с 30 микролитрами 0,4% трипанового синего цвета, затем загрузите в счетные камеры гемоцитометра для подсчета живых/мертвых клеток. Этикетирование мокроты в компенсационных трубках.Добавьте антитела HBSS и краситель в каждую трубку клетки мокроты и компенсационные трубки, как указано в тексте. Добавьте ячейки мокроты в пробирки и добавьте компенсационные шарики к компенсационным трубкам, как указано в тексте. Высиживать все тюбики на льду, защищенном от света, в течение 35 минут.Затем, заполнив трубки ледяным холодом HBSS, центрифугируют при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 800 раз больше G. Для компенсационных трубок аспирируйте супернатант как можно ближе к гранулам и щелкните гранулами, чтобы ослабить. Затем добавьте 0,5 миллилитра холодного HBSS в компенсационные трубки и храните трубки на льду в легкой защищенной зоне до тех пор, пока не понадобится анализ проточной цитометрии. Затем аспирируют супернатант из неокрашенной мокроты, изотипа, крови и эпителиальных трубок.Ослабьте гранулы, щелкнув трубками. Добавьте два миллилитра 1% PFA к неокрашенным и изотипным пробиркам и 10 миллилитрам в кровь и эпителиальные трубки. Инкубируйте трубки на льду в светозащитной манере в течение 30 минут, затем быстро вихрьте на максимальной скорости и снова высиживайте еще 30 минут.Затем наполните трубки ледяным холодом HBSS. Далее центрифугируют трубки при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 1,600 раз больше G.Аспират как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу клетки, и щелкают трубкой пальцами, чтобы ослабить клетки, затем добавляют 200 микролитров холодного HBSS в неокрашенные и изотипные трубки. Рассчитайте и сложите необходимый объем HBSS для повторного суспензии крови и эпителиальной трубки в соответствии с общим количеством клеток.Храните все образцы в компенсационных трубках, защищенных от света на льду при четырех градусах Цельсия, до тех пор, пока не будет выполнен анализ проточной цитометрии. Примените соответствующие процедуры запуска для используемого проточного цитометра. Используйте смесь бусин Национального института стандартов и технологий или NIST, чтобы гарантировать, что напряжения прямого рассеяния и бокового рассеяния установлены для размещения бусин NIST для охвата участка, не помещая бусины слишком близко к осям.Установите скорость потока на среднюю для LSRII или высокую для Navios EX. Отрегулируйте напряжение для каждого параметра, используемого для параметров рассеяния и флуоресцентных параметров, чтобы поместить популяции клеток в масштабе. Используйте цифры со стратегией гатинга в качестве руководства для соответствующей регулировки напряжения. Сначала соберите данные для неокрашенного образца мокроты, затем образца, окрашенного изотипом, а затем пробирки крови и эпителиальной трубки.Масса мокроты использовалась для определения объемов антител или красителей для окрашивания. Корреляция между массой мокроты и выходом клеток не была сильной. Образцы мокроты были разделены на четыре весовые категории, которые группировались в распределении выхода клеток.Каждое использованное антитело титровали в концентрации на фазе плато с самым высоким индексом окрашивания, выбранным в качестве рабочей концентрации. Во всех весовых категориях среднее загрязнение SEC составляло менее 20% при процентном соотношении жизнеспособных клеток. Представлена стратегия гатинга, используемая для анализа.Бусины NIST использовались для установки ворот, которые были применены к образцу мокроты для устранения мусора. Мелкий мусор был дополнительно устранен шириной ворот. Краситель жизнеспособности использовался для устранения мертвых клеток, в то время как синглетные ворота удаляли дублеты.Маркировка антител против CD45 позволила разделить живые одиночные клетки мокроты на клетку крови и некремянный клеточный компартмент. Сравнивались профили, полученные от Navios EX, LSRII и Lyric. Показана стратегия уничтожения мусора, мертвых клеток, дублетов и сравнения профилей крови и не крови.Эта методика позволила применить эти методы для выявления риска рака легких для использования в качестве неинвазивного клинического теста.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Адаптация полуавтоматического циркулирующих опухолевых клеток (СТС) Анализы для клинических и доклинических исследований приложений

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Коллекция, Изоляция и проточной цитометрии анализа человеческой Endocervical образцов

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Стереологический и проточной цитометрии Характеристика субпопуляций лейкоцитов в моделях переходных или Постоянного церебральной ишемии

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов (<em&gt; Microcystis палочки</em&gt;), Используя проточной цитометрии

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Методология для индукции мокроты и лаборатория обработки

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Характеристика иммунных клеток в жировых тканях человека с помощью проточной цитометрии

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Потока на основе цитометрии Assay для измерения митохондриальных мембранный потенциал в культивировании после гипоксии/реоксигенацию

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...