Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
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Queremos agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de la figura. Las muestras de esputo se ejecutaron en el BD LSR II en el UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, con el apoyo de UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC en UT Health) y UL1 TR001120 (subvención de CTSA).

Todos los pasos del procesamiento del esputo se realizan en un gabinete de seguridad biológica con el equipo de protección personal adecuado.
1. Preparación del reactivo antes de iniciar la disociación del esputo
<ol><li>Descongele el 1% de paraformaldehído (PFA), 25 ml por muestra en hielo y manténgalo frío hasta su uso. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico por inhalación y contacto con la piel. Prepare el fijador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y congele a -20 °C en a...

El contenido celular del esputo incluye una gran variedad de células de gran alcance, a menudo acompañadas de una gran cantidad de escombros37. Además, el análisis del esputo requiere un control de calidad que confirme que la muestra se recoge del pulmón en lugar de de la cavidad oral38. Por lo tanto, no es tan sencillo analizar el esputo por citometría de flujo como lo es para la sangre, por ejemplo, que libera una suspensión celular mucho más limpia y homogénea. ...

Los avances técnicos en el hardware y el software de los citómetros de flujo han permitido identificar muchas poblaciones celulares distintas simultáneamente1,2,3,4. La utilización del citómetro de flujo en la investigación de células hematopoyéticas, por ejemplo, ha llevado a una comprensión mucho mejor del sistema inmune2 y la jerarquía celular del sistema hematopoyético5, así como a la distinción diagnóstica de una multitud de cánceres sanguíneos diferentes6,7,8. Aunque la mayoría de las células de esputo son de origen hematopoyético9,10,11, la citometría de flujo no se ha aplicado ampliamente al análisis de esputo con fines diagnósticos. Sin embargo, varios estudios sugieren que la evaluación de las poblaciones de células inmunes en el esputo (el subconjunto más significativo de células) puede ser de gran ayuda en el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)12,13,14,15. Además, la existencia de marcadores epiteliales específicos que pueden ser utilizados en citometría de flujo permite el interrogatorio del siguiente subconjunto más significativo de células en esputo, células epiteliales pulmonares.
Además de la capacidad de analizar muchas poblaciones celulares distintas de diferentes orígenes tisulares, un citómetro de flujo puede evaluar un gran número de células en un período relativamente corto. En comparación, los tipos de análisis citológicos basados en diapositivas a menudo requieren personal y / o equipo altamente especializado. Estos análisis pueden ser intensivos en mano de obra, lo que lleva a que solo se analice una proporción de la muestra de esputo16.
Tres cuestiones críticas limitan el uso generalizado del esputo en la citometría de flujo. La primera cuestión se refiere a la recogida de esputo. El esputo se recoge a través de una tos que expulsa el moco de los pulmones a la cavidad oral, escupiendo posteriormente en una taza de recolección. Dado que el moco viaja a través de la cavidad oral, existe una alta probabilidad de contaminación por SEC. Esta contaminación complica el análisis de la muestra, pero el problema se rectifica fácilmente en una plataforma citométrica de flujo, como se muestra en este estudio.
No todo el mundo puede producir esputo espontáneamente; por lo tanto, se han desarrollado varios dispositivos para ayudar con la recolección de esputo de manera no invasiva17. El nebulizador es uno de esos dispositivos y se ha demostrado que produce muestras de esputo confiables18,19,20. Aunque el nebulizador es una forma muy efectiva de recolectar esputo de manera no invasiva, su uso aún requiere un ajuste en un centro médico con personal especializado21. Por el contrario, los dispositivos portátiles como la flauta pulmonar22,23,24 y la acapella16,25 se pueden utilizar en casa ya que son muy fáciles de usar. Estos dispositivos de asistencia son seguros y rentables.
Para nosotros, la acapella dio consistentemente mejores resultados que la flauta pulmonar16, y por lo tanto, el dispositivo de acapella ha sido elegido para las colecciones de esputo. Se decidió una muestra de recolección de 3 días porque el propósito principal del uso de esputo es desarrollar una prueba de detección de cáncer de pulmón16. Se ha demostrado que una muestra de 3 días aumenta la probabilidad de detección de cáncer de pulmón en comparación con una muestra de 1 o 2 días26,27,28. Sin embargo, otros métodos de recolección de esputo pueden ser preferibles para diferentes propósitos. Si se utiliza un método de recolección de esputo diferente al descrito aquí, se recomienda valorar cuidadosamente cada anticuerpo o colorante utilizado para el análisis citométrico de flujo; hay muy pocos datos disponibles sobre cómo los diferentes métodos de recolección de esputo afectan a las proteínas objetivo para la citometría de flujo.
El segundo problema que amortigua el entusiasmo por el uso de esputo para el diagnóstico, principalmente relacionado con la citometría de flujo, es el número de células. El problema es la recolección de suficientes células viables para un análisis confiable. Dos estudios demostraron que las muestras de esputo recolectadas por métodos no invasivos, con la ayuda de un dispositivo de asistencia, contienen suficientes células viables que pueden ser utilizadas en diagnósticos clínicos o estudios de investigación16,24. Sin embargo, ninguno de estos estudios abordó la cuestión del número de células con respecto a la citometría de flujo.
Para los estudios que forman la base de este protocolo, se recolectaron muestras de esputo de participantes con alto riesgo de desarrollar cáncer de pulmón siguiendo las pautas institucionales aprobadas para cada sitio de estudio. Los participantes de alto riesgo se definieron como entre 55 y 75 años, haber fumado 30 paquetes-año y no haber dejado de fumar en los últimos 15 años. A los pacientes se les mostró cómo usar el dispositivo de acapella de acuerdo con las instrucciones del fabricante29 y recogieron esputo durante tres días consecutivos en casa. La muestra se mantuvo en el refrigerador hasta la última recolección. El último día de recolección, la muestra se envió al laboratorio durante la noche con una compresa fría congelada. Las muestras se procesaron en una suspensión de una sola célula el día en que se recibieron. Con este método de recolección de esputo, se obtienen células viables más que suficientes para un análisis citométrico de flujo confiable.
Por último, y relacionado con el problema anterior del número de células, está la cuestión de cómo liberar las células de esputo de su entorno mucinoso. ¿Cómo se pueden mantener las células viables y crear una suspensión de una sola célula que no obstruya el citómetro de flujo? Basado en el trabajo inicial de Pizzichini et al.30 y Miller et al.31, este protocolo describe un método fácil y confiable para el procesamiento del esputo en una suspensión de una sola célula que es adecuada para el análisis citométrico de flujo. Este método ha utilizado pautas bien establecidas en citometría de flujo32,33,34 para desarrollar una estrategia eficiente de etiquetado de anticuerpos para identificar células hematopoyéticas y epiteliales en el esputo y proporcionar configuraciones de instrumentos, medidas de control de calidad y pautas de análisis que estandarizan el análisis de esputo en una plataforma citométrica de flujo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

El esputo, ampliamente utilizado para estudiar el contenido celular y otras características microambientales para comprender la salud del pulmón, se analiza tradicionalmente utilizando metodologías basadas en citología. Su utilidad es limitada porque la lectura de las diapositivas requiere mucho tiempo y requiere personal altamente especializado. Además, los desechos extensos y la presencia de demasiadas células epiteliales escamosas (SEC), o células de la mejilla, a menudo hacen que una muestra sea inadecuada para el diagnóstico. Por el contrario, la citometría de flujo permite el fenotipado de alto rendimiento de las poblaciones celulares, al tiempo que excluye los desechos y las SEC.
El protocolo presentado aquí describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula, teñir y fijar poblaciones celulares, y adquirir muestras en una plataforma citométrica de flujo. Aquí se presenta una estrategia de cierre que describe la exclusión de escombros, células muertas (incluidas las SEC) y dobletes celulares. Además, este trabajo también explica cómo analizar células viables de esputo único basadas en un grupo de poblaciones positivas y negativas de diferenciación (CD)45 para caracterizar subconjuntos de linaje hematopoyético y epitelial. También se proporciona una medida de control de calidad mediante la identificación de macrófagos específicos del pulmón como evidencia de que una muestra se deriva del pulmón y no es saliva. Finalmente, se ha demostrado que este método se puede aplicar a diferentes plataformas citométricas proporcionando perfiles de esputo de un mismo paciente analizados en tres citómetros de flujo; Navios EX, LSR II y Lyric. Además, este protocolo se puede modificar para incluir marcadores celulares adicionales de interés. Aquí se presenta un método para analizar una muestra completa de esputo en una plataforma citométrica de flujo que hace que el esputo sea susceptible de desarrollar diagnósticos de alto rendimiento de enfermedad pulmonar.

Este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta un entorno de laboratorio clínico. El enfoque durante el desarrollo del protocolo fue en la simplicidad, la eficiencia y la reproducibilidad. Se encontró que el paso más lento en el procesamiento del esputo era contar las células. Por lo tanto, el protocolo está configurado de tal manera que el procesamiento del esputo y el etiquetado celular se pueden realizar independientemente del recuento de células sin pérdida de tiempo. Luego se puede obtener un recuento celul...

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Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Este protocolo describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula y la posterior caracterización de subconjuntos celulares en plataformas citométricas de flujo estándar.

Análisis de esputo de calidad controlada por citometría de flujo

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Este protocolo resuelve los desafíos comunes experimentados con el procesamiento del esputo que han dificultado en el pasado su uso con citometría de flujo para fines de diagnóstico clínico de alto rendimiento. Este protocolo está diseñado para ahorrar tiempo mediante el uso del peso del esputo para determinar los volúmenes de tinción de anticuerpos y colorantes. Durante la incubación de la tinción, se puede realizar el recuento de células para los pasos posteriores.Es importante lograr un recuento preciso de células para determinar el volumen correcto de resuspensión para evitar cualquier problema al funcionar en el citómetro de flujo. Este protocolo puede proporcionar información sobre las áreas de investigación que investigan la salud pulmonar. Por ejemplo, se podrían estudiar enfermedades como la EPOC, el asma, el cáncer de pulmón o los efectos del COVID.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Michael Lai, un científico de investigación y desarrollo de mi laboratorio. Para empezar, pese la muestra de esputo para determinar los volúmenes de reactivos de disociación. Transfiera la muestra al recipiente del tamaño adecuado en función del peso del esputo, luego agregue un mililitro por gramo de 0.5% NAC y cuatro mililitros por gramo de 0.1% TDT.Vórtice las muestras a la velocidad máxima durante 15 segundos y roca a la velocidad máxima durante 15 minutos a temperatura ambiente. Diluya esta muestra con 4X Hanks balanced salt solution o HBSS para neutralizar el NAC y la TDT. Y después de un vórtice rápido, meca la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos.Filtre la suspensión de celdas a través de un colador de células de malla de nylon de 100 micrómetros en uno o más tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros para crear una suspensión de una sola celda. Peletizar por las células. Después de aspirar el sobrenadante, combine los gránulos en un tubo cónico de 15 mililitros y lávese con HBSS en las mismas condiciones.Resuspend el pellet celular en un volumen de tampón determinado por el peso inicial de la muestra de esputo. Tome una alícuota de la suspensión celular y mezcle 10 microlitros de la dilución de esputo con 30 microlitros de azul de tripano al 0.4%, luego cargue en las cámaras de conteo de un hemocitómetro para un recuento de células vivas / muertas. Etiquete el esputo en tubos de compensación.Agregue anticuerpos y colorantes HBSS a cada tubo de células de esputo y tubos de compensación como se indica en el texto. Agregue las células de esputo a los tubos de ensayo y agregue cuentas de compensación a los tubos de compensación como se menciona en el texto. Incubar todos los tubos en hielo protegidos de la luz durante 35 minutos.Luego, después de llenar los tubos con HBSS helado, centrífuga a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 800 veces G.Para tubos de compensación, aspire el sobrenadante lo más cerca posible de los gránulos y mueva los gránulos para aflojar. A continuación, agregue 0.5 mililitros de HBSS frío a los tubos de compensación y almacene los tubos en el hielo en un área protegida ligera hasta que sea necesario para el análisis de citometría de flujo. Luego aspire el sobrenadante del esputo sin teñir, el isotipo, la sangre y los tubos epiteliales.Afloje los gránulos moviendo los tubos. Agregue dos mililitros de 1% de PFA a los tubos no teñidos e isotipos y 10 mililitros a la sangre y los tubos epiteliales. Incubar los tubos en hielo de una manera ligeramente protegida durante 30 minutos, luego vórtice rápidamente a la velocidad máxima y nuevamente incubar durante otros 30 minutos.Luego llene los tubos con HBSS helado. A continuación, centrifugue los tubos a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 1, 600 veces G.Aspire la mayor cantidad de sobrenadante posible sin perturbar la bolita celular y mueva el tubo con los dedos para aflojar las células, luego agregue 200 microlitros de HBSS frío a los tubos no manchados e isotipo. Calcule y agregue el volumen requerido de HBSS para la resuspensión de la sangre y el tubo epitelial de acuerdo con el recuento total de células.Almacene todas las muestras en tubos de compensación protegidos de la luz en el hielo a cuatro grados centígrados hasta que se realice el análisis de citometría de flujo. Aplique los procedimientos de arranque apropiados para el citómetro de flujo que se está utilizando. Utilice la mezcla de perlas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología o NIST para asegurarse de que los voltajes de dispersión hacia adelante y de dispersión lateral estén configurados para colocar las cuentas NIST para abarcar la parcela sin colocar las cuentas demasiado cerca de los ejes.Establezca el caudal en medio para LSRII o alto para Navios EX. Ajuste los voltajes para cada parámetro utilizado para los parámetros de dispersión y fluorescentes para colocar las poblaciones celulares en escala. Utilice las figuras con la estrategia de cierre como guía para ajustar los voltajes en consecuencia. Adquiera datos para la muestra de esputo no teñida primero, seguida de la muestra teñida con isotipo, y luego el tubo sanguíneo y el tubo epitelial.El peso del esputo se utilizó para determinar los volúmenes de anticuerpos o colorantes para la tinción. La correlación entre el peso del esputo y el rendimiento celular no fue fuerte. Las muestras de esputo se dividieron en cuatro categorías de peso, que se agruparon en la distribución del rendimiento celular.Cada anticuerpo utilizado se tituló en una concentración en la fase de meseta con el índice de tinción más alto se eligió como concentración de trabajo. En todas las categorías de peso, la contaminación promedio de SEC fue inferior al 20% con el porcentaje de células viables mostrado. Se presenta la estrategia de cierre utilizada para el análisis.Las cuentas del NIST se utilizaron para establecer una puerta que se aplicó a la muestra de esputo para eliminar los escombros. Los escombros pequeños fueron eliminados aún más por la puerta de ancho. El tinte de viabilidad se utilizó para eliminar las células muertas, mientras que la puerta singlete eliminó los dobletes.El marcado de anticuerpos anti-CD45 permitió la separación de células vivas de esputo único en una célula sanguínea y un compartimento sin células sanguíneas. Se compararon los perfiles obtenidos de Navios EX, LSRII y Lyric. Se muestra la estrategia de cierre para eliminar los escombros, las células muertas, los dobletes y comparar los perfiles sanguíneos y no sanguíneos.Esta técnica nos permitió aplicar estos métodos para detectar el riesgo de cáncer de pulmón para su uso como prueba clínica no invasiva.

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Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Investigación

Medicina

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Estereológico y Citometría de Flujo Caracterización de leucocitos subpoblaciones en Modelos de transitorios o isquemia cerebral permanente

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Usando citometría de flujo

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.