Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vill tacka David Rodriguez för hans hjälp med figurförberedelserna. Sputumprover kördes på BD LSR II vid UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, med stöd av UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) och UL1 TR001120 (CTSA-bidrag).

Alla steg i sputumbehandlingen utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
1. Reagensberedning innan sputumdissociation påbörjas
<ol><li>Tina 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prov på is och håll dig kall tills den används. VARNING: PFA är giftigt vid inandning och hudkontakt. Förbered fixativet enligt tillverkarens instruktioner och frys vid -20 °C i 25 ml alikvoter tills de används.</li>
	<li>Approximera provets vikt och tina tillräcklig...

Det cellulära innehållet i sputum innehåller ett stort antal omfattande celler, ofta åtföljda av mycket skräp37. Dessutom kräver sputumanalys en kvalitetskontroll som bekräftar att provet samlas in från lungan istället för munhålan38. Därför är det inte lika enkelt att analysera sputum efter flödescytometri som det är för blod, till exempel, vilket frigör en mycket renare och homogen cellupphängning. Detta protokoll har tagit itu med alla dessa problem: ...

Tekniska framsteg inom hårdvara och programvara för flödescytometrar har gjort det möjligt att identifiera många distinkta cellpopulationer samtidigt1,2,3,4. Användningen av flödescytometern i hematopoetisk cellforskning har till exempel lett till en mycket bättre förståelse för immunsystemet2 och den cellulära hierarkin i det hematopoetiska systemet5, liksom den diagnostiska skillnaden mellan en mängd olika blodcancer6,7,8. Även om de flesta sputumceller är av hematopoietic ursprung9,10,11, flöde cytometri har inte använts i stor utsträckning på sputum analys för diagnostiska ändamål. Flera studier tyder dock på att utvärderingen av immuncellpopulationer i sputum (den viktigaste delmängden av celler) kan vara till stor hjälp vid diagnos och/eller övervakning av sjukdomar som astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)12,13,14,15. Dessutom tillåter förekomsten av epitelspecifika markörer som kan användas i flödescytometri förhör av följande viktigaste delmängd av celler i sputum, lungepitetelceller.
Förutom förmågan att analysera många distinkta cellpopulationer av olika vävnadsursprung kan en flödescytometer utvärdera ett stort antal celler på relativt kort tid. I jämförelse kräver glidbaserade, cytologiska typer av analyser ofta högspecialiserad personal och/eller utrustning. Dessa analyser kan vara arbetsintensiva, vilket leder till att endast en del av sputumprovet analyseras16.
Tre kritiska frågor begränsar den utbredda användningen av sputum i flöde cytometri. Det första numret gäller insamlingen av sputum. Sputum samlas in genom en huff hosta som utvisar slem från lungorna i munhålan och därefter spottar i en samlingskopp. Eftersom slem färdas genom munhålan finns det en stor risk för SEC-förorening. Denna förorening komplicerar provanalysen, men problemet åtgärdas enkelt på en flödescytometrisk plattform, vilket visas i denna studie.
Inte alla kan producera sputum spontant; Därför har flera enheter utvecklats för att hjälpa till med sputum insamling på ett icke-invasivt sätt17. Nebulisatorn är en sådan anordning och har visat sig producera tillförlitliga sputumprover18,19,20. Även om nebulisatorn är ett mycket effektivt sätt att icke-invasivt samla sputum, kräver dess användning fortfarande en inställning på en medicinsk anläggning med specialiserad personal21. Handhållna enheter som lungflöjt22,23,24 och acapella16,25 kan däremot användas hemma eftersom de är mycket användarvänliga. Dessa hjälpenheter är både säkra och kostnadseffektiva.
För oss gav acapella konsekvent bättre resultat än lungflöjt16, och därför har acapella-enheten valts för sputumsamlingar. Ett 3-dagars insamlingsprov bestämdes eftersom det primära syftet med att använda sputum är att utveckla ett test för lungcancerdetektering16. Det har visat sig att ett 3-dagars prov ökar sannolikheten för upptäckt av lungcancer jämfört med ett 1- eller 2-dagars prov26,27,28. Andra metoder för sputumsamling kan dock vara att föredra för olika ändamål. Om en annan sputumuppsamlingsmetod används än den som beskrivs här, rekommenderas att noggrant titrera varje antikropp eller färgämne som används för flödescytometrisk analys. det finns mycket lite data om hur olika sputum insamlingsmetoder påverkar de riktade proteinerna för flödescytometri.
Den andra frågan som dämpar entusiasmen för att använda sputum för diagnostik, främst relaterad till flödescytometri, är cellnummer. Problemet är insamlingen av tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig analys. Två studier visade att sputumprover som samlats in med icke-invasiva metoder, med hjälp av en hjälpanordning, innehåller tillräckligt med livskraftiga celler som kan användas i kliniska diagnos- eller forskningsstudier16,24. Ingen av dessa studier tog dock upp frågan om cellnummer avseende flödescytometri.
För de studier som ligger till grund för detta protokoll samlades sputumprover in från deltagare med hög risk för att utveckla lungcancer enligt godkända institutionella riktlinjer för varje studieplats. Högriskdeltagare definierades som mellan 55-75 år, efter att ha rökt 30 packår och inte slutat röka under de senaste 15 åren. Patienterna visades hur man använder acapella-enheten enligt tillverkarens instruktioner29 och samlade sputum under tre dagar i följd hemma. Provet förvarades i kylskåp fram till den sista samlingen. På den sista insamlingsdagen skickades provet till laboratoriet över natten med en frusen kall förpackning. Proverna bearbetades till en enda cell suspension samma dag som de togs emot. Med denna metod för sputum insamling erhålls mer än tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig flöde cytometrisk analys.
Slutligen, och relaterad till föregående cellnummer fråga, är frågan om hur man släpper sputumcellerna från dess mucinous miljö. Hur kan cellerna hållas livskraftiga och skapa en enda cellfjädring som inte täpper till flödescytometern? Baserat på det inledande arbetet av Pizzichini et al.30 och Miller et al.31 beskriver detta protokoll en enkel och pålitlig metod för sputumbehandling till en enda cellfjädring som är lämplig för flödescytometrisk analys. Denna metod har använt väletablerade riktlinjer i flödescytometri32,33,34 för att utveckla en effektiv antikroppsmärkningsstrategi för att identifiera hematopoetiska och epitelceller i sputum och tillhandahålla instrumentinställningar, kvalitetskontrollåtgärder och analysriktlinjer som standardiserar sputumanalys på en flödescytometrisk plattform.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Sputum, som ofta används för att studera cellulärt innehåll och andra mikromiljöfunktioner för att förstå lungans hälsa, analyseras traditionellt med hjälp av cytologibaserade metoder. Dess användbarhet är begränsad eftersom läsning av bilderna är tidskrävande och kräver högspecialiserad personal. Dessutom gör omfattande skräp och förekomsten av alltför många skivepitelceller (SECs), eller kindceller, ofta ett prov otillräckligt för diagnos. Däremot möjliggör flödescytometri fenotypning med hög genomströmning av cellulära populationer samtidigt som skräp och SEC exkluderas.
Protokollet som presenteras här beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension, antikroppsfläck och fixa cellulära populationer, och förvärva prover på en flöde cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver uteslutandet av skräp, döda celler (inklusive SECs) och celldubbel presenteras här. Vidare förklarar detta arbete också hur man analyserar livskraftiga, enstaka sputumceller baserat på ett kluster av differentiering (CD)45 positiva och negativa populationer för att karakterisera hematopoetiska och epitelial härstamning undergrupper. En kvalitetskontrollåtgärd tillhandahålls också genom att identifiera lungspecifika makrofager som bevis för att ett prov härrör från lungan och inte är saliv. Slutligen har det visats att denna metod kan tillämpas på olika cytometriska plattformar genom att tillhandahålla sputum profiler från samma patient analyseras på tre flöde cytometer. Navios EX, LSR II och Lyric. Dessutom kan detta protokoll ändras för att inkludera ytterligare cellulära markörer av intresse. En metod för att analysera ett helt sputumprov på en flöde cytometrisk plattform presenteras här som gör sputum mottaglig för att utveckla hög genomströmning diagnostik av lungsjukdom.

Detta protokoll utvecklades med en klinisk laboratorium inställning i åtanke. Fokus under utvecklingen av protokollet låg på enkelhet, effektivitet och reproducerbarhet. Det konstaterades att det mest tidskrävande steget i bearbetningen av sputum var att räkna cellerna. Därför är protokollet konfigurerat på ett sådant sätt att sputumbearbetning och cellmärkning kan utföras oberoende av cellräkning utan tidsförlust. Ett korrekt cellantal, som fortfarande är nödvändigt för att späda ut provet på lämp...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension och efterföljande karakterisering av cellulära delmängder på standard flöde cytometriska plattformar.

Kvalitetsstyrd Sputumanalys efter flödescytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Detta protokoll löser vanliga utmaningar med sputum bearbetning som har gjort det svårt tidigare att använda med flöde cytometri för hög genomströmning kliniska diagnostiska ändamål. Detta protokoll är utformat för att spara tid genom att använda sputumvikt för att bestämma antikropps- och färgfärgningsvolymer. Under färgningsinkubationen kan cellantal utföras för nedströmsstegen.Det är viktigt att uppnå ett korrekt cellantal för att bestämma rätt återfjädringsvolym för att förhindra problem när du kör på flödescytometern. Detta protokoll kan ge insikt i forskningsområden som undersöker lunghälsa. Till exempel kan sjukdomar som KOL, astma, lungcancer eller effekterna av COVID studeras.Dr Michael Lai, forskare från mitt laboratorium, demonstrerar proceduren. Till att börja med, väg sputumprovet för att bestämma volymerna av dissociation reagenser. Överför provet till det lämpligt stora kärlet baserat på sputumvikten och tillsätt sedan en milliliter per gram 0,5 %NAC och fyra milliliter per gram 0,1 %DTT.Virvla proverna med maximal hastighet i 15 sekunder och stena med maximal hastighet i 15 minuter vid rumstemperatur. Späd ut detta prov med 4X Hanks balanserad saltlösning eller HBSS för att neutralisera NAC och DTT. Och efter snabb virvel, rocka provet vid rumstemperatur i fem minuter.Filtrera cellfjädringen genom en 100 mikrometer nylonnätcellsil i ett eller flera 50 milliliter koniska centrifugrör för att skapa en encellig suspension. Pellet ner i cellerna. Efter inandning av supernatanten, kombinera pellets i ett 15 milliliter koniskt rör och tvätta med HBSS under samma förhållanden.Återutnyttja cellpelleten i en buffertvolym som bestäms av sputumprovets ursprungliga vikt. Ta en alikvot från cellupphängningen och blanda 10 mikroliter av sputumutspädningen med 30 mikroliter på 0,4% trypanblå och ladda sedan in i räkningskamrarna på en hemocytometer för ett levande/ dött cellantal. Etikett sputum i kompensationsrör.Tillsätt HBSS-antikropp och färgämne till varje sputumcellsrör och kompensationsrör enligt texten. Tillsätt sputumcellerna i analysrören och lägg till kompensationspärlor till kompensationsrören som nämns i texten. Inkubera alla rör på is som är skyddade mot ljus i 35 minuter.Sedan efter att ha fyllt rören med iskall HBSS, centrifugera vid fyra grader Celsius i 10 minuter vid 800 gånger G.För kompensationsrör, aspirera supernatanten så nära pelletsen som möjligt och snärta pelletsen för att lossa. Tillsätt sedan 0,5 millimeter kall HBSS till kompensationsrören och förvara rören på isen i ett ljusskyddat område tills det behövs för flödescytometrianalys. Aspirera sedan supernatanten från sputum unstained, isotyp, blod och epitelial rör.Lossa pelletsen genom att snärta rören. Tillsätt två milliliter 1%PFA till de oförstätliga och isotyprören och 10 milliliter till blodet och epitelrören. Inkubera rören på is på ett ljusskyddat sätt i 30 minuter, virvla sedan snabbt med maximal hastighet och inkubera igen i ytterligare 30 minuter.Fyll sedan rören med iskall HBSS. Centrifugera sedan rören vid fyra grader Celsius i 10 minuter vid 1 600 gånger G.Aspirate så mycket supernatant som möjligt utan att störa cellpelleten och snärta röret med fingrarna för att lossa cellerna och tillsätt sedan 200 mikroliter av kalla HBSS till de oförstörda och isotyprören. Beräkna och tillsätt den önskade volymen HBSS för återupplivning av blod och epitelslang enligt det totala antalet celler.Förvara alla prover i kompensationsrör skyddade mot ljus på isen vid fyra grader Celsius tills flödescytometrianalys utförs. Tillämpa lämpliga startprocedurer för den flödescytometer som används. Använd blandningen av National Institute of Standards and Technology eller NIST pärlor för att säkerställa att framåt spridning och sida spridning spänningar är inställda för att placera NIST pärlor för att spänna över tomten utan att placera pärlor för nära axlarna.Ställ in flödeshastigheten på medium för LSRII eller hög för Navios EX. Justera spänningarna för varje parameter som används för spridnings- och fluorescerande parametrar för att placera cellpopulationerna i skala. Använd siffrorna med gatingstrategin som vägledning för att justera spänningarna i enlighet därmed. Skaffa data för det oförstörda sputumprovet först, följt av det isotypfärgade provet, och sedan blodröret och epitelröret.Sputum vikt användes för att bestämma antikropps- eller färgämnen volymer för färgning. Korrelationen mellan sputum vikt och cell avkastning var inte stark. Sputumprover delades in i fyra viktkategorier, som grupperades i fördelningen av cellutbyte.Varje antikropp som användes titrerades i en koncentration på platåfasen med det högsta färgningsindexet valdes som arbetskoncentration. I alla viktkategorier var den genomsnittliga SEC-föroreningen mindre än 20%med procentandelen livskraftiga celler som visades. Presenteras är den gating strategi som används för analys.NIST pärlor användes för att ställa in en grind som applicerades på sputum provet för att eliminera skräp. Små skräp eliminerades ytterligare av breddporten. Livskraft färgämne användes för att eliminera döda celler, medan singlet gate bort dubbletter.Antikroppsmärkningen mot CD45 tillät separation av levande enstaka sputumceller i en blodcell och ett icke-blodcellsfack. Profilerna från Navios EX, LSRII och Lyric jämfördes. Gating-strategin för att eliminera skräp, döda celler, dubbletter och jämföra blod- och icke-blodprofiler visas.Denna teknik gjorde det möjligt för oss att tillämpa dessa metoder för att upptäcka lungcancerrisk för användning som ett icke-invasivt kliniskt test.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Anpassning av halvautomatiserad cirkulerande tumör Cell (CTC) Analyser för klinisk och preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Insamling, Isolering och flödescytometrisk analys av Human endocervikala prover

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Stereologisk och flödescytometri karakterisering av Leukocyte Subpopulationer i Modeller av övergående eller permanenta cerebral ischemi

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Molecular Probe Optimization för att bestämma cell Dödligheten i en Photo Organism (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Med användning av flödescytometri

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- och flödescytometri-baserad analys av cell Position och cellcykeln i 3D Melanom Sfäroider

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Metodik för Sputum induktion och laboratorium bearbetning

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering av immunceller i mänsklig fettvävnad med hjälp av flödescytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Ett flöde flödescytometri-baserad analys för att mäta mitokondriella membranet Potential i hjärt myocyter efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...