Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vill tacka David Rodriguez för hans hjälp med figurförberedelserna. Sputumprover kördes på BD LSR II vid UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, med stöd av UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) och UL1 TR001120 (CTSA-bidrag).

Alla steg i sputumbehandlingen utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
1. Reagensberedning innan sputumdissociation påbörjas
<ol><li>Tina 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prov på is och håll dig kall tills den används. VARNING: PFA är giftigt vid inandning och hudkontakt. Förbered fixativet enligt tillverkarens instruktioner och frys vid -20 °C i 25 ml alikvoter tills de används.</li>
	<li>Approximera provets vikt och tina tillräcklig...

Det cellulära innehållet i sputum innehåller ett stort antal omfattande celler, ofta åtföljda av mycket skräp37. Dessutom kräver sputumanalys en kvalitetskontroll som bekräftar att provet samlas in från lungan istället för munhålan38. Därför är det inte lika enkelt att analysera sputum efter flödescytometri som det är för blod, till exempel, vilket frigör en mycket renare och homogen cellupphängning. Detta protokoll har tagit itu med alla dessa problem: ...

Tekniska framsteg inom hårdvara och programvara för flödescytometrar har gjort det möjligt att identifiera många distinkta cellpopulationer samtidigt1,2,3,4. Användningen av flödescytometern i hematopoetisk cellforskning har till exempel lett till en mycket bättre förståelse för immunsystemet2 och den cellulära hierarkin i det hematopoetiska systemet5, liksom den diagnostiska skillnaden mellan en mängd olika blodcancer6,7,8. Även om de flesta sputumceller är av hematopoietic ursprung9,10,11, flöde cytometri har inte använts i stor utsträckning på sputum analys för diagnostiska ändamål. Flera studier tyder dock på att utvärderingen av immuncellpopulationer i sputum (den viktigaste delmängden av celler) kan vara till stor hjälp vid diagnos och/eller övervakning av sjukdomar som astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)12,13,14,15. Dessutom tillåter förekomsten av epitelspecifika markörer som kan användas i flödescytometri förhör av följande viktigaste delmängd av celler i sputum, lungepitetelceller.
Förutom förmågan att analysera många distinkta cellpopulationer av olika vävnadsursprung kan en flödescytometer utvärdera ett stort antal celler på relativt kort tid. I jämförelse kräver glidbaserade, cytologiska typer av analyser ofta högspecialiserad personal och/eller utrustning. Dessa analyser kan vara arbetsintensiva, vilket leder till att endast en del av sputumprovet analyseras16.
Tre kritiska frågor begränsar den utbredda användningen av sputum i flöde cytometri. Det första numret gäller insamlingen av sputum. Sputum samlas in genom en huff hosta som utvisar slem från lungorna i munhålan och därefter spottar i en samlingskopp. Eftersom slem färdas genom munhålan finns det en stor risk för SEC-förorening. Denna förorening komplicerar provanalysen, men problemet åtgärdas enkelt på en flödescytometrisk plattform, vilket visas i denna studie.
Inte alla kan producera sputum spontant; Därför har flera enheter utvecklats för att hjälpa till med sputum insamling på ett icke-invasivt sätt17. Nebulisatorn är en sådan anordning och har visat sig producera tillförlitliga sputumprover18,19,20. Även om nebulisatorn är ett mycket effektivt sätt att icke-invasivt samla sputum, kräver dess användning fortfarande en inställning på en medicinsk anläggning med specialiserad personal21. Handhållna enheter som lungflöjt22,23,24 och acapella16,25 kan däremot användas hemma eftersom de är mycket användarvänliga. Dessa hjälpenheter är både säkra och kostnadseffektiva.
För oss gav acapella konsekvent bättre resultat än lungflöjt16, och därför har acapella-enheten valts för sputumsamlingar. Ett 3-dagars insamlingsprov bestämdes eftersom det primära syftet med att använda sputum är att utveckla ett test för lungcancerdetektering16. Det har visat sig att ett 3-dagars prov ökar sannolikheten för upptäckt av lungcancer jämfört med ett 1- eller 2-dagars prov26,27,28. Andra metoder för sputumsamling kan dock vara att föredra för olika ändamål. Om en annan sputumuppsamlingsmetod används än den som beskrivs här, rekommenderas att noggrant titrera varje antikropp eller färgämne som används för flödescytometrisk analys. det finns mycket lite data om hur olika sputum insamlingsmetoder påverkar de riktade proteinerna för flödescytometri.
Den andra frågan som dämpar entusiasmen för att använda sputum för diagnostik, främst relaterad till flödescytometri, är cellnummer. Problemet är insamlingen av tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig analys. Två studier visade att sputumprover som samlats in med icke-invasiva metoder, med hjälp av en hjälpanordning, innehåller tillräckligt med livskraftiga celler som kan användas i kliniska diagnos- eller forskningsstudier16,24. Ingen av dessa studier tog dock upp frågan om cellnummer avseende flödescytometri.
För de studier som ligger till grund för detta protokoll samlades sputumprover in från deltagare med hög risk för att utveckla lungcancer enligt godkända institutionella riktlinjer för varje studieplats. Högriskdeltagare definierades som mellan 55-75 år, efter att ha rökt 30 packår och inte slutat röka under de senaste 15 åren. Patienterna visades hur man använder acapella-enheten enligt tillverkarens instruktioner29 och samlade sputum under tre dagar i följd hemma. Provet förvarades i kylskåp fram till den sista samlingen. På den sista insamlingsdagen skickades provet till laboratoriet över natten med en frusen kall förpackning. Proverna bearbetades till en enda cell suspension samma dag som de togs emot. Med denna metod för sputum insamling erhålls mer än tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig flöde cytometrisk analys.
Slutligen, och relaterad till föregående cellnummer fråga, är frågan om hur man släpper sputumcellerna från dess mucinous miljö. Hur kan cellerna hållas livskraftiga och skapa en enda cellfjädring som inte täpper till flödescytometern? Baserat på det inledande arbetet av Pizzichini et al.30 och Miller et al.31 beskriver detta protokoll en enkel och pålitlig metod för sputumbehandling till en enda cellfjädring som är lämplig för flödescytometrisk analys. Denna metod har använt väletablerade riktlinjer i flödescytometri32,33,34 för att utveckla en effektiv antikroppsmärkningsstrategi för att identifiera hematopoetiska och epitelceller i sputum och tillhandahålla instrumentinställningar, kvalitetskontrollåtgärder och analysriktlinjer som standardiserar sputumanalys på en flödescytometrisk plattform.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Sputum, som ofta används för att studera cellulärt innehåll och andra mikromiljöfunktioner för att förstå lungans hälsa, analyseras traditionellt med hjälp av cytologibaserade metoder. Dess användbarhet är begränsad eftersom läsning av bilderna är tidskrävande och kräver högspecialiserad personal. Dessutom gör omfattande skräp och förekomsten av alltför många skivepitelceller (SECs), eller kindceller, ofta ett prov otillräckligt för diagnos. Däremot möjliggör flödescytometri fenotypning med hög genomströmning av cellulära populationer samtidigt som skräp och SEC exkluderas.
Protokollet som presenteras här beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension, antikroppsfläck och fixa cellulära populationer, och förvärva prover på en flöde cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver uteslutandet av skräp, döda celler (inklusive SECs) och celldubbel presenteras här. Vidare förklarar detta arbete också hur man analyserar livskraftiga, enstaka sputumceller baserat på ett kluster av differentiering (CD)45 positiva och negativa populationer för att karakterisera hematopoetiska och epitelial härstamning undergrupper. En kvalitetskontrollåtgärd tillhandahålls också genom att identifiera lungspecifika makrofager som bevis för att ett prov härrör från lungan och inte är saliv. Slutligen har det visats att denna metod kan tillämpas på olika cytometriska plattformar genom att tillhandahålla sputum profiler från samma patient analyseras på tre flöde cytometer. Navios EX, LSR II och Lyric. Dessutom kan detta protokoll ändras för att inkludera ytterligare cellulära markörer av intresse. En metod för att analysera ett helt sputumprov på en flöde cytometrisk plattform presenteras här som gör sputum mottaglig för att utveckla hög genomströmning diagnostik av lungsjukdom.

Detta protokoll utvecklades med en klinisk laboratorium inställning i åtanke. Fokus under utvecklingen av protokollet låg på enkelhet, effektivitet och reproducerbarhet. Det konstaterades att det mest tidskrävande steget i bearbetningen av sputum var att räkna cellerna. Därför är protokollet konfigurerat på ett sådant sätt att sputumbearbetning och cellmärkning kan utföras oberoende av cellräkning utan tidsförlust. Ett korrekt cellantal, som fortfarande är nödvändigt för att späda ut provet på lämp...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension och efterföljande karakterisering av cellulära delmängder på standard flöde cytometriska plattformar.

Kvalitetsstyrd Sputumanalys efter flödescytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Detta protokoll löser vanliga utmaningar med sputum bearbetning som har gjort det svårt tidigare att använda med flöde cytometri för hög genomströmning kliniska diagnostiska ändamål. Detta protokoll är utformat för att spara tid genom att använda sputumvikt för att bestämma antikropps- och färgfärgningsvolymer. Under färgningsinkubationen kan cellantal utföras för nedströmsstegen.Det är viktigt att uppnå ett korrekt cellantal för att bestämma rätt återfjädringsvolym för att förhindra problem när du kör på flödescytometern. Detta protokoll kan ge insikt i forskningsområden som undersöker lunghälsa. Till exempel kan sjukdomar som KOL, astma, lungcancer eller effekterna av COVID studeras.Dr Michael Lai, forskare från mitt laboratorium, demonstrerar proceduren. Till att börja med, väg sputumprovet för att bestämma volymerna av dissociation reagenser. Överför provet till det lämpligt stora kärlet baserat på sputumvikten och tillsätt sedan en milliliter per gram 0,5 %NAC och fyra milliliter per gram 0,1 %DTT.Virvla proverna med maximal hastighet i 15 sekunder och stena med maximal hastighet i 15 minuter vid rumstemperatur. Späd ut detta prov med 4X Hanks balanserad saltlösning eller HBSS för att neutralisera NAC och DTT. Och efter snabb virvel, rocka provet vid rumstemperatur i fem minuter.Filtrera cellfjädringen genom en 100 mikrometer nylonnätcellsil i ett eller flera 50 milliliter koniska centrifugrör för att skapa en encellig suspension. Pellet ner i cellerna. Efter inandning av supernatanten, kombinera pellets i ett 15 milliliter koniskt rör och tvätta med HBSS under samma förhållanden.Återutnyttja cellpelleten i en buffertvolym som bestäms av sputumprovets ursprungliga vikt. Ta en alikvot från cellupphängningen och blanda 10 mikroliter av sputumutspädningen med 30 mikroliter på 0,4% trypanblå och ladda sedan in i räkningskamrarna på en hemocytometer för ett levande/ dött cellantal. Etikett sputum i kompensationsrör.Tillsätt HBSS-antikropp och färgämne till varje sputumcellsrör och kompensationsrör enligt texten. Tillsätt sputumcellerna i analysrören och lägg till kompensationspärlor till kompensationsrören som nämns i texten. Inkubera alla rör på is som är skyddade mot ljus i 35 minuter.Sedan efter att ha fyllt rören med iskall HBSS, centrifugera vid fyra grader Celsius i 10 minuter vid 800 gånger G.För kompensationsrör, aspirera supernatanten så nära pelletsen som möjligt och snärta pelletsen för att lossa. Tillsätt sedan 0,5 millimeter kall HBSS till kompensationsrören och förvara rören på isen i ett ljusskyddat område tills det behövs för flödescytometrianalys. Aspirera sedan supernatanten från sputum unstained, isotyp, blod och epitelial rör.Lossa pelletsen genom att snärta rören. Tillsätt två milliliter 1%PFA till de oförstätliga och isotyprören och 10 milliliter till blodet och epitelrören. Inkubera rören på is på ett ljusskyddat sätt i 30 minuter, virvla sedan snabbt med maximal hastighet och inkubera igen i ytterligare 30 minuter.Fyll sedan rören med iskall HBSS. Centrifugera sedan rören vid fyra grader Celsius i 10 minuter vid 1 600 gånger G.Aspirate så mycket supernatant som möjligt utan att störa cellpelleten och snärta röret med fingrarna för att lossa cellerna och tillsätt sedan 200 mikroliter av kalla HBSS till de oförstörda och isotyprören. Beräkna och tillsätt den önskade volymen HBSS för återupplivning av blod och epitelslang enligt det totala antalet celler.Förvara alla prover i kompensationsrör skyddade mot ljus på isen vid fyra grader Celsius tills flödescytometrianalys utförs. Tillämpa lämpliga startprocedurer för den flödescytometer som används. Använd blandningen av National Institute of Standards and Technology eller NIST pärlor för att säkerställa att framåt spridning och sida spridning spänningar är inställda för att placera NIST pärlor för att spänna över tomten utan att placera pärlor för nära axlarna.Ställ in flödeshastigheten på medium för LSRII eller hög för Navios EX. Justera spänningarna för varje parameter som används för spridnings- och fluorescerande parametrar för att placera cellpopulationerna i skala. Använd siffrorna med gatingstrategin som vägledning för att justera spänningarna i enlighet därmed. Skaffa data för det oförstörda sputumprovet först, följt av det isotypfärgade provet, och sedan blodröret och epitelröret.Sputum vikt användes för att bestämma antikropps- eller färgämnen volymer för färgning. Korrelationen mellan sputum vikt och cell avkastning var inte stark. Sputumprover delades in i fyra viktkategorier, som grupperades i fördelningen av cellutbyte.Varje antikropp som användes titrerades i en koncentration på platåfasen med det högsta färgningsindexet valdes som arbetskoncentration. I alla viktkategorier var den genomsnittliga SEC-föroreningen mindre än 20%med procentandelen livskraftiga celler som visades. Presenteras är den gating strategi som används för analys.NIST pärlor användes för att ställa in en grind som applicerades på sputum provet för att eliminera skräp. Små skräp eliminerades ytterligare av breddporten. Livskraft färgämne användes för att eliminera döda celler, medan singlet gate bort dubbletter.Antikroppsmärkningen mot CD45 tillät separation av levande enstaka sputumceller i en blodcell och ett icke-blodcellsfack. Profilerna från Navios EX, LSRII och Lyric jämfördes. Gating-strategin för att eliminera skräp, döda celler, dubbletter och jämföra blod- och icke-blodprofiler visas.Denna teknik gjorde det möjligt för oss att tillämpa dessa metoder för att upptäcka lungcancerrisk för användning som ett icke-invasivt kliniskt test.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Anpassning av halvautomatiserad cirkulerande tumör Cell (CTC) Analyser för klinisk och preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Insamling, Isolering och flödescytometrisk analys av Human endocervikala prover

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereologisk och flödescytometri karakterisering av Leukocyte Subpopulationer i Modeller av övergående eller permanenta cerebral ischemi

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe Optimization för att bestämma cell Dödligheten i en Photo Organism (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Med användning av flödescytometri

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- och flödescytometri-baserad analys av cell Position och cellcykeln i 3D Melanom Sfäroider

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodik för Sputum induktion och laboratorium bearbetning

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Karakterisering av immunceller i mänsklig fettvävnad med hjälp av flödescytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Ett flöde flödescytometri-baserad analys för att mäta mitokondriella membranet Potential i hjärt myocyter efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.