Name: quality-controlled sputum analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

David Rodriguez'e figür hazırlığındaki yardımı için teşekkür etmek istiyoruz. Balgam örnekleri UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) ve UL1 TR001120 (CTSA hibesi) tarafından desteklenen UT Health San Antonio Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'ndeki BD LSR II'de çalıştırıldı.

Balgam işlemenin tüm adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.
1. Balgam ayrışmaya başlamadan önce reaktif hazırlama
<ol><li>%1 Paraformaldehit (PFA), buzda numune başına 25 mL çözün ve kullanıma kadar soğuk tutun. DİkKAT: PFA inhalasyon ve cilt teması ile toksiktir. Düzelticiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kullanıma kadar 25 mL aliquots içinde -20 °C'de dondurun.</li>
	<li>Numunenin ağ...

Balganın hücresel içeriği, genellikle çok fazla enkazla birlikte çok çeşitli hücreler içerir37. Ek olarak, balgam analizi, numunenin ağız boşluğu yerine akciğerden toplandığını doğrulayan bir kalite kontrolü gerektirir38. Bu nedenle, balgamumu akış sitometrisi ile analiz etmek, örneğin çok daha temiz ve homojen bir hücre süspansiyonu serbest bırakan kan için olduğu kadar basit değildir. Bu protokol tüm bu sorunları ele almıştır: hem en k...

Akış sitometrelerinin donanım ve yazılımındaki teknik gelişmeler, birçok farklı hücre popülasyonunun aynı anda tanımlanmasını mümkün kıldı1,2,3,4. Örneğin, hematopoetik hücre araştırmalarında akış sitometresinin kullanılması, bağışıklık sisteminin çok daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır2 ve hematopoetik sistemin hücresel hiyerarşisi5, ayrıca çok sayıda farklı kan kanserinin tanısal ayrımı6,7,8. Balgam hücrelerinin çoğu hematopoetik kökenli olmasına rağmen9,10,11, akış sitometrisi tanı amaçlı balgam analizine yaygın olarak uygulanmamıştır. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar balgamdaki bağışıklık hücresi popülasyonlarının değerlendirilmesinin (hücrelerin en önemli alt kümesi) astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hastalıkların teşhis ve / veya izlenmesinde büyük yardımcı olabileceğini göstermektedir 12,13,14,15. Ayrıca, akış sitometrisinde kullanılabilecek epitel spesifik belirteçlerin varlığı, balgam, akciğer epitel hücrelerindeki aşağıdaki en önemli hücre alt kümesinin sorgulanmasını sağlar.
Farklı doku kökenli birçok farklı hücre popülasyonunun analiz yeteneğine ek olarak, bir akış sitometresi çok sayıda hücreyi nispeten kısa bir sürede değerlendirebilir. Buna karşılık, slayt tabanlı, sitolojik analiz türleri genellikle son derece uzmanlaşmış personel ve / veya ekipman gerektirir. Bu analizler emek yoğun olabilir, bu da balgam örneğinin sadece bir kısmının analiz edilmesine neden olur16.
Üç kritik konu, akış sitometrisinde balgam kullanımının yaygın kullanımını sınırlar. İlk sayı balgam koleksiyonu ile ilgilidir. Balgam, mukusu akciğerlerden ağız boşluğuna dışarı atarak daha sonra bir toplama kabına tüküren bir huff öksürüğü ile toplanır. Mukus ağız boşluğundan geçtiği için SEC kontaminasyonu olasılığı yüksektir. Bu kontaminasyon numune analizini zorlaştırır, ancak sorun bu çalışmada gösterildiği gibi bir akış sitometrik platformunda kolayca düzeltilir.
Herkes kendiliğinden balgam üretemez; bu nedenle, balgam koleksiyonuna invaziv olmayan bir şekilde yardımcı olmak için çeşitli cihazlar geliştirilmiştir17. Nebülizör böyle bir cihazdır ve güvenilir balgam örnekleri ürettiği gösterilmiştir18,19,20. Nebülizör, balgamını invaziv olmayan bir şekilde toplamanın çok etkili bir yolu olmasına rağmen, kullanımı hala uzman personele sahip bir tıbbi tesiste bir ayar gerektirir21. Buna karşılık, akciğer flütü22,23,24 ve acapella16,25 gibi el cihazları çok kullanıcı dostu oldukları için evde kullanılabilir. Bu yardımcı cihazlar hem güvenli hem de uygun maliyetlidir.
Bizim için, acapella akciğer flütü16'dan sürekli olarak daha iyi sonuçlar verdi ve bu nedenle, acapella cihazı balgam koleksiyonları için seçildi. Balgam kullanmanın birincil amacı akciğer kanseri tespit testi geliştirmek olduğu için 3 günlük toplama örneğine karar verildi16. 3 günlük bir örneğin akciğer kanseri tespit olasılığını 1 veya 2 günlük bir örneğe kıyasla artırdığı gösterilmiştir26,27,28. Bununla birlikte, balgam toplamanın diğer yöntemleri farklı amaçlar için tercih edilebilir. Burada açıklanandan farklı bir balgam toplama yöntemi kullanılıyorsa, akış sitometrik analizi için kullanılan her antikor veya boyanın dikkatlice titratlanmasınız önerilir; farklı balgam toplama yöntemlerinin akış sitometrisi için hedeflenen proteinleri nasıl etkilediği hakkında çok az veri mevcuttur.
Öncelikle akış sitometrisi ile ilgili tanılama için balgam kullanma hevesini sönümleyen ikinci konu hücre numarasıdır. Sorun, güvenilir bir analiz için yeterli uygulanabilir hücrelerin toplanmasıdır. İki çalışma, invaziv olmayan yöntemlerle toplanan balgam örneklerinin, bir yardımcı cihaz yardımıyla, klinik tanı veya araştırma çalışmalarında kullanılabilecek yeterli uygulanabilir hücre içerdiğini göstermiştir16,24. Bununla birlikte, bu çalışmaların hiçbiri akış sitometrisi ile ilgili hücre sayıları sorununu ele almamıştır.
Bu protokolün temelini oluşturan çalışmalar için, her çalışma alanı için onaylanmış kurumsal kılavuzları izleyerek akciğer kanserine yakalanma riski yüksek katılımcılardan balgam örnekleri toplanarak alındı. Yüksek riskli katılımcılar 55-75 yaşları arasında, 30 paket yıl sigara içmiş ve son 15 yıl içinde sigarayı bırakmamış olarak tanımlanmıştır. Hastalara acapella cihazının üreticinin talimatlarına göre nasıl kullanılacağı gösterildi29 ve evde art arda üç gün boyunca balgam toplandı. Numune son koleksiyona kadar buzdolabında muhafaza edildi. Son toplama gününde, numune donmuş bir soğuk paketle bir gecede laboratuvara gönderildi. Numuneler alındıkları gün tek bir hücre süspansiyonuna işlendi. Bu balgam toplama yöntemi ile güvenilir bir akış sitometrik analizi için fazlasıyla uygulanabilir hücre elde edilir.
Son olarak ve önceki hücre sayısı sorunu ile ilgili olarak, balgam hücrelerinin mucinous ortamından nasıl serbest bırakılacağı sorusudur. Hücreler nasıl canlı tutulabilir ve akış sitometresini tıkamayan tek bir hücre süspansiyonu oluşturabilir? Pizzichini ve ark.30 ve Miller ve ark.31'in ilk çalışmalarına dayanarak, bu protokol balgam işleme için akış sitometrik analizi için uygun olan tek bir hücre süspansiyonuna kolay ve güvenilir bir yöntem açıklar. Bu yöntem, balgamdaki hematopoetik ve epitel hücrelerini tanımlamak ve bir akış sitometrik platformunda balgam analizini standartlaştıran cihaz ayarları, kalite kontrol önlemleri ve analiz kılavuzları sağlamak için verimli bir antikor etiketleme stratejisi geliştirmek için akış sitometrisinde iyi belirlenmiş kılavuzlar kullanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>25037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOH</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0593-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti-human cytokeratin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>628608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510 anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b FITC isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBead Plus Compensation Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD66b</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowSet</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A69184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 05 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 20 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST Beads, 30 &#956;M</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>64170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CR594 anti-human CD206</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0445-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quality-controlled sputum analysis by flow cytometry

Akciğerin sağlığını anlamak için hücresel içeriği ve diğer mikroçevronmental özellikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan balgam, geleneksel olarak sitoloji tabanlı metodolojiler kullanılarak analiz edilir. Slaytları okumak zaman alıcı olduğundan ve son derece uzmanlaşmış personel gerektirdiğinden, yardımcı programı sınırlıdır. Ayrıca, geniş döküntüler ve çok fazla skuamöz epitel hücresinin (SEC) veya yanak hücrelerinin varlığı, genellikle bir örneği tanı için yetersiz hale getirir. Buna karşılık, akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli fenotiplemesine izin verirken aynı zamanda döküntüleri ve DC'leri hariç tutmaktadır.
Burada sunulan protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna, antikor lekesine ve hücresel popülasyonları düzeltmeye ve akış sitometrik platformunda örnekler almaya yönelik etkili bir yöntemi açıklar. Enkaz, ölü hücreler (SEC'ler dahil) ve hücre çiftlerinin hariç tutulmasını açıklayan bir gating stratejisi burada sunulmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, hematopoetik ve epitel soy alt kümelerini karakterize etmek için bir farklılaşma kümesine (CD)45 pozitif ve negatif popülasyona dayanarak uygulanabilir, tek balgam hücrelerinin nasıl analiz edilip edilecektir. Akciğere özgü makrofajların akciğerden örnek elde edildiğinin ve tükürük olmadığının kanıtı olarak tanımlanmasıyla da bir kalite kontrol önlemi sağlanır. Son olarak, bu yöntemin üç akış sitometresinde analiz edilen aynı hastadan balgam profilleri sağlanarak farklı sitometrik platformlara uygulanabileceği gösterilmiştir; Navios EX, LSR II ve Lirik. Ayrıca, bu protokol ek hücresel ilgi işaretlerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Bir akış sitometrik platformunda tüm balgam örneğini analiz etmek için bir yöntem burada sunulmaktadır, bu da balgamını akciğer hastalığının yüksek verimli tanısını geliştirmek için uygun hale getirir.

Bu protokol klinik laboratuvar ayarı göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Protokolün geliştirilmesi sırasında odak noktası basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlikti. Balgamının işlenmesinde en çok zaman alan adımın hücreleri saymak olduğu bulunmuştur. Bu nedenle protokol, balgam işleme ve hücre etiketlemesi zaman kaybı olmadan hücre sayımından bağımsız olarak gerçekleştirilebilecek şekilde ayarlanır. Numuneyi engelsiz bir çalışma için uygun şekilde seyreltmek için hala ger...

Watch this Scientific Journal Video about Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Bu protokol, balgam işleme ile ilgili geçmişte yüksek verimli klinik tanı amaçları için akış sitometrisi ile kullanımını zorlaştıran yaygın zorlukları çözer. Bu protokol, antikor ve boya boyama hacimlerini belirlemek için balgam ağırlığı kullanılarak zaman kazanmak için tasarlanmıştır. Boyama inkübasyonu sırasında, aşağı akış adımları için hücre sayımı yapılabilir.Akış sitometresinde çalışırken herhangi bir sorunu önlemek için doğru yeniden süspansiyon hacmini belirlemek için doğru bir hücre sayısı elde etmek önemlidir. Bu protokol, akciğer sağlığını araştıran araştırma alanlarına ilişkin içgörü sağlayabilir. Örneğin KOAH, astım, akciğer kanseri gibi hastalıklar veya COVID'in etkileri incelenebilir.Prosedürü gösteren dr. Michael Lai olacak, laboratuvarımdan bir araştırma ve geliştirme bilimcisi. Başlangıç olarak, ayrışma reaktiflerinin hacimlerini belirlemek için balgam örneğini tartın. Numuneyi balgam ağırlığına göre uygun büyüklükteki gemiye aktarın, ardından %0,5 NAC gram başına bir mililitre ve gram başına %0,1 DTT'lik dört mililitre ekleyin.Örnekleri 15 saniye boyunca maksimum hızda vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca maksimum hızda kayan. NAC ve DTT'yi nötralize etmek için bu numuneyi 4X Hanks dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile seyreltin. Ve hızlı girdaplamadan sonra, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika sallayın.Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için hücre süspansiyonunu 100 mikrometre naylon ağ hücresi süzgecinden bir veya daha fazla 50 mililitre konik santrifüj tüpüne filtreleyin. Pelet hücreleri aşağı. Süpernatant aspirasyondan sonra, peletleri bir 15 mililitrelik konik tüpte birleştirin ve aynı koşullar altında HBSS ile yıkayın.Hücre peletini balgam örneğinin ilk ağırlığına göre belirlenen bir arabellek hacminde yeniden kullanın. Hücre süspansiyonundan bir aliquot alın ve balgam seyreltmenin 10 mikrolitresini% 0.4 trippan mavisi 30 mikrolitre ile karıştırın, ardından canlı / ölü hücre sayısı için bir hemositometrenin sayım odalarına yükleyin. Kompanzasyon tüplerinde balgam etiketle.Metinde belirtildiği gibi her balgam hücresi tüpüne ve kompanzasyon tüplerine HBSS antikoru ve boyası ekleyin. Balgam hücrelerini tahlil tüplerine ekleyin ve metinde belirtildiği gibi kompanzasyon tüplerine kompanzasyon boncukları ekleyin. Işıktan korunan buz üzerindeki tüm tüpleri 35 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.Daha sonra tüpleri buz gibi HBSS ile doldurduktan sonra, 800 kez G.For compensation tüplerinde 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin, süpernatantı peletlere mümkün olduğunca yakın emiş ve gevşetmek için peletleri hafifçe vurun. Daha sonra, kompanzasyon tüplerine 0,5 mililitre soğuk HBSS ekleyin ve tüpleri akış sitometri analizi için gerekli olana kadar hafif korumalı bir alanda buz üzerinde saklayın. Daha sonra balgamsız, izotip, kan ve epitel tüplerinden süpernatantı aspire edin.Tüpleri sallayarak peletleri gevşetin. Lekesiz ve izotip tüplere iki mililitre%1 PFA ve kan ve epitel tüplerine 10 mililitre ekleyin. Tüpleri 30 dakika boyunca hafif korumalı bir şekilde buz üzerinde kuluçkaya yatırın, ardından maksimum hızda hızlı bir şekilde girdap yapın ve tekrar 30 dakika daha kuluçkaya yatın.Daha sonra tüpleri buz gibi HBSS ile doldurun. Daha sonra, tüpleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1,600 kez Santrifüjleyin G.Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant aspire edin ve hücreleri gevşetmek için tüpü parmaklarla hareket ettirin, ardından lekesiz ve izotip tüplere 200 mikrolitre soğuk HBSS ekleyin. Toplam hücre sayısına göre kan ve epitel tüpünün yeniden canlandırılması için gerekli HBSS hacmini hesaplayın ve ekleyin.Akış sitometri analizi yapılana kadar tüm numuneleri dört santigrat derecede buz üzerindeki ışıktan korunan kompanzasyon tüplerinde saklayın. Kullanılan akış sitometresi için uygun başlangıç yordamlarını uygulayın. İleri saçılma ve yan dağılım voltajlarının, boncukları eksenlere çok yakın yerleştirmeden arsayı kaplamak için nist boncuklarını yerleştirmek üzere ayarlandığını sağlamak için Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü veya NIST boncuklarının karışımını kullanın.Akış hızını LSRII için orta veya Navios EX için yüksek olarak ayarlayın. Hücre popülasyonlarını ölçeğe yerleştirmek için dağılım ve floresan parametreleri için kullanılan her parametre için voltajları ayarlayın. Gerilimleri buna göre ayarlamak için kılavuz olarak gating stratejisine sahip figürleri kullanın. Önce lekesiz balgam örneği, ardından izotip lekeli örnek ve ardından kan tüpü ve epitel tüpü için veri alın.Lekeleme için antikor veya boya hacimlerini belirlemek için balgam ağırlığı kullanıldı. Balgam ağırlığı ve hücre verimi arasındaki korelasyon güçlü değildi. Balgam örnekleri, hücre veriminin dağılımında kümelenen dört ağırlık kategorisine ayrılmıştır.Kullanılan her antikor plato fazında bir konsantrasyonda titratlandı ve en yüksek boyama indeksi çalışma konsantrasyonu olarak seçildi. Tüm ağırlık kategorilerinde, ortalama SEC kontaminasyonu, gösterilen canlı hücrelerin yüzdesi ile% 20'den azdı. Sunulan analiz için kullanılan gating stratejisidir.Nist boncukları, enkazı ortadan kaldırmak için balgam örneğine uygulanan bir kapı kurmak için kullanıldı. Küçük enkaz genişlik kapısı tarafından daha da ortadan kaldırıldı. Canlılık boyası ölü hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılırken, singlet kapısı çiftleri çıkardı.Anti-CD45 antikor etiketlemesi, canlı tek balgam hücrelerinin bir kan hücresine ve kan dışı bir hücre bölmesine ayrılmasına izin veriyordu. Navios EX, LSRII ve Lirik'ten elde edilen profiller karşılaştırıldı. Enkazı, ölü hücreleri, çiftleri ortadan kaldırmak ve kan ve kan dışı profilleri karşılaştırmak için gating stratejisi gösterilmiştir.Bu teknik, invaziv olmayan bir klinik test olarak kullanılmak üzere akciğer kanseri riskini tespit etmek için bu yöntemleri uygulamamızı sağladı.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Diagnostic Studies of Respiratory System

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Tıp

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodoloji balgam indüksiyon ve laboratuvar için

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow cytometry (MFC) for myeloid disease diagnosis in France. The protocol presented here was agreed-upon and applied between September 2013 and November 2015 in six French diagnostic laboratories (University Hospitals of Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, and Lille and Institut Paoli-Calmettes in Marseille) and allowed the standardization of bone marrow sample preparation and data acquisition. Three maturation databases were developed for neutrophil, monocytic, and erythroid lineages with bone marrow from "healthy" donor individuals (individuals without any evidence of a hematopoietic disease). A robust method of analysis for each myeloid lineage should be applicable for routine diagnostic use. New cases can be analyzed in the same manner and compared against the usual databases. Thus, quantitative and qualitative phenotypic abnormalities can be identified and those above 2SD compared with data of normal bone marrow samples should be considered indicative of pathology. The major limitation is the higher variability between the data achieved using the monoclonal antibodies obtained with the methods based on hybridoma technologies and currently used in clinical diagnosis. Setting criteria for technical validation of the data acquired may help improve the utility of MFC for MDS diagnostics. The establishment of these criteria requires analysis against a database. The reduction of investigator subjectivity in data analysis is an important advantage of this method.

The MDS diagnosis is difficult in the absence of morphological criteria or non-informative cytogenetics. MFC could help refine the MDS diagnostic process. To become useful for clinical practice, the MFC analysis must be based on parameters with sufficient specificity and sensitivity, and data should be reproducible between different operators.