Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato in parte da RSF (grant #17-15-01290) e RFBR (grant #19-015-00273). Gli autori ringraziano il programma di sviluppo della Lomonosov Moscow State University (PNR 5.13) e il Nikon Center of Excellence in correlative imaging presso il Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology per l'accesso alla strumentazione di imaging.

Il protocollo è ottimizzato per le cellule aderenti ed è stato testato su linee cellulari HeLa, HT1080 e CHO.
1. Etichettatura e fissazione delle celle
<ol><li>Cellule di piastre su coperture pulite con acido in una capsula di Petri di 3 cm. Far crescere le cellule nel mezzo raccomandato per la linea cellulare utilizzata al 70% di confluenza.</li>
	<li>Aggiungere EdU (5-etinile-2'-deossiuridina) da 10 mM di stock a 10 μM di concentrazione finale e posizionare le cellule n...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

Il metodo qui descritto presenta diversi vantaggi rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza. In primo luogo, l'uso della Chimica del clic per etichettare il DNA replicato elimina la necessità del prerequisito di denaturazione del DNA per il rilevamento di BrdU con anticorpi, preservando così meglio l'ultrastruttura della cromatina. 
In secondo luogo, l'utilizzo della biotina come ligando secondario generato dopo la fissazione della glutaraldeide e la corretta tempra dei gruppi aldeidic...

La replicazione del DNA è un processo biologico di base necessario per la copia fedele e la trasmissione delle informazioni genetiche durante la divisione cellulare. Negli eucarioti superiori, la replicazione del DNA è soggetta a una stretta regolazione spazio-temporale, che si manifesta nell'attivazione sequenziale delle origini di replicazione1. Le origini di replica vicine che sparano in modo sincrono formano cluster di replicons2. A livello di microscopia ottica, i siti di replicazione del DNA in corso vengono rilevati come focolai di replicazione di vari numeri e dimensioni. I focolai di replicazione mostrano modelli specifici di distribuzione spaziale all'interno del nucleo cellulare a seconda dei tempi di replicazione del DNA marcato 3,4, che, a sua volta, è strettamente correlato con la sua attività genica. Grazie a una sequenza ben definita di replicazione del DNA, rigorosamente ordinata nello spazio e nel tempo, l'etichettatura replicativa è un potente metodo di marcatura precisa del DNA non solo per lo studio del processo di replicazione in sé, ma anche per discriminare una specifica sottofrazione del DNA con attività di trascrizione e livello di compattazione definiti. La visualizzazione della cromatina replicante viene solitamente eseguita attraverso la rilevazione dei principali componenti proteici del meccanismo di replicazione del DNA (mediante immunocolorazione o espressione di tag proteici fluorescenti 5,6) o mediante incorporazione di precursori di sintesi del DNA modificati 7,8,9,10 . Di questi, solo i metodi basati sull'incorporazione di nucleotidi modificati nel DNA appena replicato consentono la cattura di cambiamenti conformazionali nella cromatina durante la replicazione e tracciano il comportamento dei domini replicativi dopo che la loro replicazione è stata completata.
Negli eucarioti superiori, il confezionamento del DNA in cromatina aggiunge un altro livello di complessità alla regolazione delle funzioni genetiche di base (trascrizione, replicazione, riparazione, ecc.). Il ripiegamento della cromatina influisce sull'accessibilità del DNA ai fattori trans regolatori e ai cambiamenti conformazionali del DNA (svolgimento a doppia elica) necessari per la sintesi del modello. Pertanto, è generalmente accettato che i processi sintetici dipendenti dal DNA nel nucleo cellulare richiedano una transizione strutturale della cromatina dal suo stato condensato e repressivo a una conformazione più accessibile e aperta. Citologicamente, questi due stati della cromatina sono definiti come eterocromatina ed eucromatina. Tuttavia, non c'è ancora consenso riguardo alla modalità di ripiegamento del DNA nel nucleo. Le ipotesi vanno da un modello di "fusione polimerica"11, in cui la fibra nucleosomiale si comporta come un polimero casuale per il quale la densità di impacchettamento è controllata da meccanismi di separazione di fase, a modelli gerarchici di piegatura postulando la formazione sequenziale di strutture simili a fibre di cromatina di spessore crescente12,13. I modelli di ripiegamento gerarchico hanno recentemente ottenuto il supporto di approcci molecolari basati sull'analisi dei contatti DNA-DNA in situ (cattura della conformazione cromosomica, 3C), dimostrando l'esistenza della gerarchia dei domini strutturali della cromatina14. È importante notare che le unità di replicazione sono correlate molto bene a questi domini della cromatina15. La principale critica di questi modelli si basa sulla potenziale aggregazione di cromatina artificiale causata da procedure di preparazione del campione, come la permeabilizzazione delle membrane cellulari e la rimozione di componenti non cromatinici, al fine di migliorare il contrasto della cromatina per studi ultrastrutturali migliorando al contempo l'accessibilità della cromatina per varie sonde (ad esempio, anticorpi). I recenti progressi tecnici nella colorazione selettiva del DNA per la microscopia elettronica mediante foto-ossidazione mediata da fluoroforo-legante il DNA della diaminobenzidina (ChromEMT6) hanno permesso l'eliminazione di questo ostacolo. Tuttavia, le stesse considerazioni valgono per la visualizzazione al microscopio elettronico del DNA replicante17,18. Qui descriviamo una tecnica che consente la mappatura ultrastrutturale simultanea ad alta risoluzione del DNA appena sintetizzato e della cromatina totale in cellule aldeidi-reticolate intatte. La tecnica combina il rilevamento del DNA marcato edU mediante Click-chemistry con sonde biotinilate e streptavidina-Nanogold e ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

I principi del ripiegamento del DNA nel nucleo cellulare e le sue trasformazioni dinamiche che avvengono durante l'adempimento delle funzioni genetiche di base (trascrizione, replicazione, segregazione, ecc.) rimangono poco compresi, in parte a causa della mancanza di approcci sperimentali alla visualizzazione ad alta risoluzione di specifici loci di cromatina in nuclei strutturalmente conservati. Qui presentiamo un protocollo per la visualizzazione di domini replicativi in colture cellulari monostrato in situ, combinando l'etichettatura EdU del DNA appena sintetizzato con la successiva rilevazione dell'etichetta con Ag-amplificazione delle particelle Nanogold e colorazione ChromEM della cromatina. Questo protocollo consente l'etichettatura pre-incorporamento ad alto contrasto e ad alta efficienza, compatibile con la tradizionale fissazione della glutaraldeide che fornisce la migliore conservazione strutturale della cromatina per l'elaborazione dei campioni a temperatura ambiente. Un altro vantaggio dell'etichettatura pre-incorporante è la possibilità di preselezionare le celle di interesse per il sezionamento. Ciò è particolarmente importante per l'analisi di popolazioni cellulari eterogenee, nonché per la compatibilità con gli approcci di tomografia elettronica all'analisi 3D ad alta risoluzione dell'organizzazione della cromatina nei siti di replicazione e all'analisi del riarrangiamento della cromatina post-replicativa e della segregazione cromatidica sorella nell'interfase.

I focolai di replicazione nei nuclei cellulari di mammifero mostrano modelli distinti di distribuzione all'interno del nucleo a seconda della progressione della fase S. Questi modelli sono correlati all'attività trascrizionale dei loci replicati. Poiché il metodo qui presentato utilizza una procedura di fissazione piuttosto forte, è abbastanza semplice utilizzare l'etichettatura replicativa degli impulsi per il rilevamento specifico dei loci della cromatina in vari stati trascrizionali, anche in condizioni che offrono...

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Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Questo protocollo presenta una tecnica per la mappatura ad alta risoluzione dei siti di replicazione in cromatina strutturalmente conservata in situ che impiega una combinazione di marcatura EdU-streptavidin-Nanogold pre-incorporante e ChromEMT.

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Presentiamo un protocollo per la visualizzazione al microscopio elettronico dei domini replicativi nella cellula mediante l'etichettatura EdU del DNA appena sintetizzato e il rilevamento dell'etichetta con potenziamento dell'argento delle particelle Nanogold e colorazione ChromEM della cromatina. Questo protocollo fornisce l'etichettatura pre-incorporamento ad alto contrasto con la tradizionale fissazione della glutaraldeide che offre la migliore conservazione strutturale della cromatina per l'elaborazione del campione a temperatura ambiente. Questo protocollo è ottimizzato per la cellula di aderenza che cresce sui coverslip nella capsula di Petri.Aggiungere EdU a 10 micro moli concentrazione finale e posizionare le cellule nell'incubatore per il tempo di etichettatura desiderato. Fissare le cellule etichettate con gluaradeidrato al 2,5% in una soluzione di cacodilato di sodio da 100 millimoli per un'ora. Un tempo di fissazione più lungo può influire negativamente sull'etichettatura EdU.Rimuovere la glutaraldeide risciacquando i campioni con PBS integrato con cinque millimoli di cloruro di magnesio, ulteriormente considerato come stella PBS. Lavare tre volte per 10 minuti. Permeabilizzare le membrane plasmatiche con una soluzione all'1% di Trione X-100 nella stella PBS, apportare due modifiche per cinque minuti ciascuna.Questa soluzione è ulteriormente indicata come stella PBS T.Lavare estensivamente il campione con la stella PBS. Cinque cambi per cinque minuti ciascuno. Spegnere i gruppi di aldeide residua con 20 millimoli di glicina nella stella PBS, due volte per 10 minuti.Posizionare il campione nella stella PBS con l'1% di BSA per mezz'ora. Durante il blocco in BSA, preparare il cocktail di reazione per il rilevamento edU. L'ordine di aggiunta dei componenti è importante.La coniugazione edU biotina-azide viene eseguita nella camera umida per ridurre al minimo l'evaporazione e gli spostamenti di concentrazione nel cocktail di reazione. Preparare la camera umida. Posizionare il coverslip sul para-film con una cella rivolta verso l'alto e lo strato da 50 a 100 microlitri del cocktail di reazione sul coverslip.La reazione richiede 30 minuti a temperatura ambiente. Interrompere la reazione lavando il campione nella stella PBS T, cinque volte per cinque minuti ciascuna. Blocca di nuovo con l'1% BSA nella stella PBS T per un'altra mezz'ora.Preparare la soluzione di streptavidina-Nanogold in PBS stella T con 1% BSA. Incubare il campione con streptavidina durante la notte a più quattro gradi in una camera umida appena preparata. La procedura è la stessa della coniugazione Biotina-azide EdU.Interrompere la reazione e lavare il campione, cinque volte per 10 minuti ciascuno con la stella PBS T.Stabilizzare il complesso di streptavidina biotina mediante fissazione aggiuntiva sarà 1% glutaraldeide PBS stella per mezz'ora. Rimuovere la glutaraldeide mediante lavaggio intenso con acqua deionizzata. Spegnere i gruppi di aldeide residua con un milligrammo per millilitro di boroidruro di sodio.Lavare di nuovo accuratamente. Il prossimo passo è aumentare le dimensioni delle particelle di Nanogold per mezzo della deposizione di argento sul corso d'oro. Preparare le premiscele per ridurre al minimo l'attività della camera oscura.Equilibrare i campioni con tampone di lavaggio e procedere in una camera oscura. Nella camera oscura mescolare i componenti per preparare la soluzione di lavaggio e applicarla ai campioni. La soluzione di polvere di acacia è altamente visibile.Quindi, durante la miscelazione dei componenti, scuotere lentamente il tubo per evitare la formazione di bolle e schiuma. La reazione richiede da due a cinque minuti. Si consiglia di eseguire un test per determinare il tempo di reazione ottimale.Un tempo di incubazione più lungo può comportare una deposizione di argento non specifica. Per fermare la reazione, risciacquare rapidamente il campione con tre o cinque cambi di acqua deionizzata. Seguito da altri tre cambi per cinque minuti ciascuno.Per proteggere le nanoparticelle d'argento dalla dissoluzione da parte del tetrossido di osmio, incubare i campioni in acido tetracloroaurico allo 0,05% per due minuti al buio. Lavare accuratamente con acqua deionizzata. In questa fase, viene aggiunto un ulteriore contrasto al materiale contenente DNA.Saturare il campione con la macchia di DNA DRAQ5. Aggiungere la soluzione di diamionobenzidina al campione e incubare per un minuto. Spostare il coperchio nella capsula di Petri con fondo di vetro e posizionarlo sul palco del microscopio invertito.Irradiare diversi campi visivi con luce rossa a 640 nanometri. Il pannello di sinistra mostra lo sbiancamento fotografico completo di DRAQ5. Sul pannello di destra, lo stesso campo visivo viene ripreso nella luce trasmessa che mostra il precipitato DAB.Lavare i campioni con acqua deionizzata. La fase successiva dovrebbe essere eseguita sotto il cofano dei fumi. Soluzione di tetrossido di osmio parzialmente ridotta preparata.Stai attento. Questa sostanza è altamente volatile e tossica. Applicare la soluzione preparata sul campione.In questa fase, i composti di osmio ridotti reagiscono con le deposizioni di diamionobenzidina e aumentano il contrasto del DNA. Smaltire la soluzione contenente osmio secondo la normativa locale e lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno. Il campione viene ulteriormente disidratato in una serie di concentrazioni crescenti di etanolo seguite dall'infiltrazione delle cellule con miscele di resina etanolo.Sostituire la miscela di resina alcolica con resina pura appena preparata. Riempire lo stampo di incorporamento di dimensioni adeguate con una resina appena preparata. Posizionare il coperchio con una cella rivolta verso il basso sopra la cavità riempita di resina.Polimerizzare la resina per 24 ore a 37 gradi. Quindi a 60 gradi per almeno due giorni. Rimuovere la resina da una superficie inferiore di una copertura.Far cadere la lastra in un azoto liquido e quindi trasferirla in acqua bollente. Il vetro dovrebbe staccarsi. Ripetere l'operazione se necessario.I campi visivi irradiati dovrebbero essere chiaramente visibili a causa della deposizione di diamionobenzidina e della colorazione DAB. Ritaglia l'area di interesse dalla lastra usando il seghetto o qualsiasi altro strumento adatto. Posizionare il ritaglio nel supporto semplice ultramicrotome.Impostare l'ultramicrotomo per il taglio del blocco finale. Usando la lama del rasoio, prepara il pillet a forma di piramide. La dimensione di un'area piatta in cima alla piramide dovrebbe essere di circa 400 per 200 micron.Montare la piramide preparata nel braccio ultramicrotomico e installare il coltello. Preparare le sezioni. Lo spessore della sezione può essere regolato in base alle esigenze sperimentali.Puntiamo alla tomografia EM. Così abbiamo preparato sezioni con uno spessore di 250 nanometri denominate anche sezioni semisottili. Staccare le sezioni dal bordo del coltello e montarle su una griglia a fessura.Abbiamo usato una griglia a fessura, erano rotondi di un millimetro per essere intorno, un millimetro di apertura laterale. Le dimensioni ridotte dell'apertura forniscono una migliore stabilità delle sezioni. Lasciare asciugare i campioni sulla griglia.In questo momento, le sezioni sono pronte per l'osservazione. Posizionare la griglia nel portacampioni del microscopio elettronico. Caricare il campione nel microscopio elettronico.Acquisire serie di inclinazione. I focolai di replicazione nei nuclei cellulari di mammifero mostrano modelli distinti di distribuzione a seconda della progressione della fase S. Il successo dell'etichettatura EdU confermata dalla reazione del clic con azide marcata fluorescentemente dimostra il tipico modello di replicazione nella popolazione cellulare eterogenea dopo la fissazione della glutaraldeide in cima.L'etichettatura della streptavidina può essere influenzata dalla glutaraldeide. Quindi prima controlla la colorazione di streptavidina a fluorescenza nelle stesse condizioni della streptavidina nanogold sul fondo. Un buon risultato della procedura di miglioramento dell'argento è una colorazione marrone scuro di alcuni nuclei e una macchia di citoplasto giallo molto svenuta, mostrata sul fondo.Il vantaggio di un'etichettatura pre-incorporamento è la possibilità di selezionare le celle per il sezionamento. È possibile in questa fase perché i modelli di etichettatura diventano visibili al microscopio a campo luminoso. L'etichettatura appropriata genera siti di replica ben delimitati.Arrowhead mostra le fibre di cromatina macchiate DAB. L'etichettatura di sfondo sulla destra è limitata a poche nanoparticelle per micron quadrato. Le sezioni semisottili sono pronte per la tomografia e non richiedono l'aggiunta di nanoparticelle d'oro.L'approccio descritto utilizzato per gli studi sull'organizzazione della cromatina in siti con replicazione abilitata. Per l'analisi del riarrangiamento post replicativo della cromatina, compresa l'imaging ad alta risoluzione della segregazione della cromatina. Utilizzato anche per l'etichettatura replicata di grandi domini cromosomici e studi di ripiegamento della cromatina di ordine superiore e di eterocromatina.Questa tecnica di imaging è importante anche come punto di riferimento per i dati generati da altri approcci non microscopici. Il metodo può anche essere adattato in studi microscopici correlati, comprese le tecniche di super risoluzione. Questo apre nuovi orizzonti negli studi sulla struttura di ordine superiore della cromatina e sulla sua dinamica nei vari stati fisiologici della cellula.

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